4.3 Linssin rakkulasta kypsäksi linssiksi
Linssin rakkula muodostuu sulkeutumalla linssikuppi (tunnetaan myös nimellä linssikuoppa) ja irtautumalla pinnallisesta ektodermistä. Välivaiheena on linssin varren kehittyminen, joka pitää suljetun vesikkelin ja pintaekodermin yhdessä muutaman tunnin ajan (hiirellä). Linssin vesikkeli on lähes pallomainen, ja siinä on suuri keskeinen ontelo; sen takapuolella olevat solut pidentyvät, kunnes ne saavuttavat etupuolen epiteelisolut ja täyttävät koko linssin vesikkelin; näitä pidentyneitä soluja kutsutaan primäärisiksi linssikuitusoluiksi. Tämä vaihe tapahtuu ihmisalkioissa noin 44. raskauspäivänä ja hiirissä E11,5. päivänä (kuva 10.5). Linssin rakkulan etupuolella olevat solut jäävät epiteelisoluiksi. Linssin epiteelin keskiosaa ympäröivät mitoottisesti aktiiviset solut siirtyvät ekvatoriaaliselle alueelle (tai linssin kaaren alueelle), jossa ne pidentyvät ja erilaistuvat sekundaarisiksi linssikuiduiksi. Keskiviivaa, jossa ekvaattorin vastakkaisista kohdista tulevat sekundaariset linssikuidut yhtyvät, kutsutaan etu- ja takalinssin saumaksi. Toissijaiset linssikuidut muodostavat samankeskisiä kerroksia linssin ytimen primaaristen kuitujen ympärille (hiirellä päivänä E15,5; kuva 10.5). Tällä järjestelyllä linssin periferiaan päin suuntautuvat linssikuidut ovat peräkkäin nuorempia kehityksen ja erilaistumisen kannalta. Niin kauan kuin linssi kasvaa, uudet sekundääriset kuidut siirtyvät ekvaattorista linssin ulkokuorelle.
Kuva 10.5. Linssin muodostuminen. Kun linssivesikkeli on muodostunut, primaariset linssikuidut pidentyvät linssivesikkelin takaosan epiteelistä ja täyttävät sen koko luumenin. Sekundääriset kuitusolut alkavat pidentyä linssin keulan alueella; vastakkaisilta puolilta tulevat kuidut kohtaavat etu- ja takapuolella ja synnyttävät linssin ompeleet (jotka ovat kolmiulotteisessa näkymässä Y:n muotoisia). Linssin erilaistumisen viimeinen vaihe on solujen tuman ja mitokondrioiden hajoaminen, joka tapahtuu hiirellä syntymän aikoihin (muokattu Graw’n mukaan, 2003; Nature Publishing Groupin luvalla).
Sekä primaaristen että sekundaaristen kuitujen solut menettävät mitokondrioitaan ja soluytimiään lopullisen erilaistumisprosessin aikana: primaaristen kuitujen osalta se tapahtuu hiirillä E17/E18 -vaiheessa, ja se viimeistellään 2 viikkoa syntymän jälkeen, kun hiiret avaavat silmäluomensa (Vrensen ym, 1991). Sekundääriset kuitusolut, jotka ympäröivät primaarisia kuitusoluja, menettävät organellinsa, kun ne siirtyvät ulkokuoresta sisempään kuoreen (Kuwabara ja Imaizumi, 1974).
Eteläepiteelisolut pysyvät kuitenkin mitoottisesti aktiivisina kantasolunicheina, jotka tuottavat sekundäärisiä kuitusoluja. Nämä sekundaariset linssin kuitusolut ovat terminaalisesti erilaistuneita soluja ja menettävät myös organellinsa, kun peräkkäiset kuitusolut painautuvat syvemmälle linssin sisään.
Seeprakalassa linssin kehityksessä ja erilaistumisessa on kuitenkin useita eroja. Erityisesti primaaristen kuitusolujen pidentyminen tapahtuu ympyränmuotoisesti, mikä johtaa alkion linssiytimeen, jossa on keskittyneitä kuitujen kuoria. Erilaistuvien sekundääristen kuitujen ytimien hyvin tiheä etäisyys toisistaan kapealla vyöhykkeellä lähellä ekvatoriaalista epiteeliä viittaa kuitenkin siihen, että sekundääristen kuitusolujen erilaistuminen poikkeaa nisäkkäiden tai lintujen linsseistä kuvatusta. Näiden erojen vuoksi on oltava varovainen ekstrapoloitaessa seeprakaloilla tehtyjä havaintoja hiiren tai ihmisen linssin kehitykseen tai toimintaan (Dahm ym., 2007).
Hiirillä ainakin kaksi geeniä, Pitx3 ja Foxe3, luonnehtivat linssin varren vaiheen ohimenevyyden merkitystä. Hiiren alkioissa Pitx3 ilmentyy kehittyvässä linssissä E11:stä alkaen, ensin linssin vesikkelissä ja myöhemmin etummaisessa epiteelissä ja linssin ekvaattorissa. Pitx3-geenin säätely- tai koodausalueiden mutaatioiden on osoitettu aiheuttavan afaakia- (ak) tai silmättömien (eyl) hiirimutaatioiden fenotyypin, joista puuttuu linssi ja pupilli (Rieger ym., 2001; Rosemann ym., 2010; Semina ym., 2000). Näillä hiirillä linssin varsi säilyy useita päiviä, mikä johtaa lopulta rudimentaarisen linssin rakkulan hajoamiseen, ja verkkokalvokudos täyttää koko silmänpallon. Koska Pitx3 ilmentyy myös substantia nigran dopaminergisissä neuroneissa, nämä hiiret ovat myös erinomaisia malleja Parkinsonin taudille (Rosemann ym., 2010). Blixt ym. (2000) osoittivat, että dyl-fenotyyppiä välittää mutaatio Foxe3-geenissä. Hiirellä FoxE3-geeni ekspressoituu kehittyvässä silmässä noin E9,5:n tienoilla, linssin istukan induktion alkaessa (kuva 10.2). Linssin istukan muodostuessa FoxE3:n ilmentyminen lisääntyy ja rajoittuu linssin vesikkeliin, kun se irtoaa pintaekodermista. Dyl-hiirissä tunnistettiin kaksi mutaatiota FoxE3:n DNA:ta sitovassa domeenissa. Ihmisillä FOXE3:n mutaatiot aiheuttavat etusegmentin optisen dysgeneesin (ASOD). FOXE3:n ilmentymismallin ja heterotsygoottisten dyl-hiirten vaihtelevan fenotyypin vuoksi FOXE3-mutaatioiden varalta seulottiin pieni kohortti potilaita, joilla oli Petersin anomalia ja joilla ei voitu havaita PAX6-mutaatioita. Yksi potilaista osoittautui heterotsygoottiseksi Arg90Leu-substituution suhteen, joka vaikuttaa FOXE3:n DNA:ta sitovaan domeeniin (Ormestad ym., 2002).
Toinen tärkeä vaihe on linssin rakkulan takapuoliskon solujen pidentyminen ja täyttyminen primaarisilla kuitusoluilla. Hiirimutaatiossa ”läpinäkymättömät pilkut linssissä” pistemutaatio vaikuttaa Mafin (jota koodaa onkogeeni, joka on vastuussa musculoaponeuroottisesta fibrosarkoomasta) perusalueeseen ja estää primääristen linssisäikeiden oikean muodostumisen, mikä johtaa fenotyyppiin, joka on samankaltainen kuin erään ihmisen suvussa esiintyvä pulverulenttinen harmaakaihi (Lyon ym., 2003). Nisäkkäiden MAF ilmentyy linssin istukassa ja linssin rakkulassa ja myöhemmin primäärisissä linssikuiduissa.
Puk ym. (2008) luonnehtivat hiljattain uuden etyylinitroso-urean (ENU) aiheuttaman hiirimutaatin, jolla on pienisilmäinen fenotyyppi ja tyhjä linssin rakkula homotsygoottisessa tilassa. Tässä tapauksessa tunnistettiin mutaatio geenissä Gjf1 (tunnetaan myös nimellä Gje1). Hiirellä geeni Gjf1 koodaa 23,8 kDa:n kokoista konneksiinin kaltaista proteiinia, joka ilmentyy linssin rakkulan takaosassa, josta primäärikuitujen pidentyminen alkaa. Mutanteissa Pax6:n, Prox1:n, Six3:n ja Crygd:n ilmentymismalli on muuttunut, mutta ei Pax2:n. Geeni Gjf1:n uskotaan olevan välttämätön primääristen linssikuitujen muodostumiselle (Puk ym., 2008), ja sitä voitaisiin pitää transkriptiotekijä c-Maf:n downstream-kohteena; vastaavan Maf-geenin mutaatiot johtavat samanlaiseen fenotyyppiin hiirellä (Lyon ym., 2003; Perveen ym., 2007). Tällä hetkellä ei ole selvää, onko hiiren Gjf1-geenille olemassa toimivaa vastinetta ihmisessä.
Kolmas fenotyyppi ilman primääristen linssisäikeiden pidentymistä aiheutuu Pparbp-geenin (joka koodaa peroksisomeja aktivoivan proliferaattorin aktivaattorireseptorin sitovaa proteiinia (peroxisome proliferator activator receptor binding protein); Crawford ym. ym., 2002) tyrmäyksestä. Näiden kolmen toiminnallisesti erilaisen proteiinin välinen suhde primääristen linssikuitusolujen muodostumiseen ei ole vielä selvillä.
Näiden kolmen geenin lisäksi myös Wnt-signaloinnilla saattaa olla merkitystä primääristen kuitusolujen pidentymisessä. Faber ym. raportoivat vuonna 2002 Bmp-reseptorin 1b:n (geenisymboli: Bmpr1b) dominoivan negatiivisen muodon transgeenisissä hiirissä. Näissä transgeenisissä hiirimutaatioissa primaaristen kuitusolujen kehityksen estyminen oli kuitenkin epäsymmetristä: se ilmeni vain linssin nasaalipuolella ventraalisessa puoliskossa. Kirjoittajat päättelivät, että erilaiset erilaistumisstimulaatiot saattavat olla aktiivisia eri kvadranteissa.
Linssin etupuolella linssin epiteelisolut ovat edelleen linssin ainoat mitoottisesti aktiiviset solut. Niille on ominaista useiden Wnt-geenien jatkuva ilmentyminen: raportoidut yksityiskohtaiset ilmentymistiedot eivät kuitenkaan ole erilaisia ainoastaan kananpoikien ja hiirien välillä, vaan ne vaihtelevat myös eri hiirikantojen välillä (ks. tarkemmin katsaus de Iongh et al., 2006). On kuitenkin selvää, että Wnt-signalointireitin geenit ilmentyvät pääasiassa linssin epiteelisoluissa. Johdonmukaisesti myös Fzd-reseptorien (geenisymbolit: Fzd1-8) ja yhteisreseptorien Lrp5 ja Lrp6, Sfrp1-3 ja Dkk1-3 geenien on osoitettu ilmentyvän linssin kehityksen aikana. Ne esiintyvät pääasiassa epiteelisoluissa; ainoa poikkeus on Fzd6, joka ilmentyy yhä enemmän erilaistuvissa kuitusoluissa (de Iongh ym., 2006). Esimerkkinä on analysoitu lrp6-nollamutantteja, joilla on (joidenkin muiden vikojen lisäksi; ks. MGI-tietokanta) pienet silmät ja poikkeavat linssit, joille on ominaista epätäydellisesti muodostunut etummainen epiteeli, mikä johtaa linssin kuitujen ekstrusoitumiseen sarveiskalvon yläpuoliseen sarveiskalvon sarveiskalvostroomaan (Stump ym., 2003).
Linssin kuitusolujen erilaistumisen keskeisin laukaisijalähete on kuitenkin Fgf-merkkiyhteys. Yksi merkittävimmistä havainnoista osoitti rotan linssin läpivalaisussa, että eri pitoisuudet Fgf2:ta (aiemmin tunnettu nimellä ”perus-Fgf” tai ”bFGF”) ovat vastuussa linssisolujen proliferaatiosta, migraatiosta ja linssikuitusolujen erilaistumisesta (McAvoy ja Chamberlain, 1989). Koska vielä ei tiedetä, mitkä useista Fgf:istä osallistuvat linssin induktioon (Smith ym., 2010), tutkimukset olivat keskittyneet Fgf-reseptoreihin. Kuten edellä mainittiin, linssien kuitusolujen pidentymisessä ilmeni vakavia puutteita linsseissä, joista puuttui kolme Fgf-reseptorigeeniä (Fgfr1-3; Zhao ym., 2008). Fgf-signalointi on myös välttämätöntä ei-kanonisen Wnt-reitin käynnistämiseksi (ts, riippumatta β-kateniinista) linssin epiteelisoluissa; linssin läpivalaisussa se johtaa kuitusolujen erilaistumista merkitsevän β-kristallinin kertymiseen (Lyo ja Joo, 2004). Vastaavien geenien (tai tiettyjen transkriptiotekijöiden) mutaatiot johtavat toiminnalliseen epätasapainoon ja linssin samentumiseen (kaihi). Kaihin puhkeamisikä ja periytymistapa riippuvat vastaavien geenien ilmentymisestä ja alueesta, johon mutaatio vaikuttaa. Kaikkiaan ∼60 eri geenin tiedetään olevan vastuussa kaihin muodostumisesta hiirillä ja ihmisillä. Yksityiskohtainen keskustelu vastaavista mutaatioista ja niiden toiminnallisista seurauksista ei kuulu tämän luvun piiriin; kirjoittaja on hiljattain julkaissut tätä aihetta vastaavat katsaukset (Graw, 2009a,b).