Asymmetric synthesis of batrachotoxin: Enantiomeeriset toksiinit osoittavat toiminnallista eroavaisuutta NaV:tä vastaan

Kaikkien akuuttien myrkkyjen fenotyyppiset vaikutukset, jotka löytyvät maa- ja merieläinten rikkaasta farmakopeasta, on dokumentoitu antiikin ajoista lähtien. Myrkyllisten yhdisteiden eristäminen ja karakterisointi ovat antaneet käyttöön tärkeitä kemiallisia reagensseja monimutkaisten biokemiallisten piirien tutkimiseen (1). Tämäntyyppiset tutkimukset ovat paljastaneet suuren määrän peptidi- ja pienimolekyylisiä aineita, jotka kohdistuvat jänniteohjattuihin natriumionikanaviin (NaV), jotka ovat pakollinen kalvoproteiinien luokka biosähköistä signalointia varten (1-4). Tunnettujen NaV-modulaattoreiden joukossa on kolme rakenteellisesti toisiinsa liittyvää ainetta, (-)-batrachotoksiini , veratridiini ja konitiini (kuva 1A) -steroidisesti suuret, lipofiiliset amiinijohdannaiset, joilla uskotaan olevan yhteinen sitoutumispaikka NaV:n (3) sisäisen huokosen alueella (paikka 2, kuva 1B). Näiden toksiinien vaikutus ionisulkuun eroaa kuitenkin selvästi. Toisessa ääripäässä (-)-BTX, kolumbialaisten myrkkysammakoiden (Phyllobates-suku) ensisijainen myrkyllinen ainesosa, on täysi NaV-agonisti, joka saa kanavan avautumaan helpommin hyperpolarisoituneilla kalvopotentiaaleilla ja estää nopean inaktivoitumisen (muiden tyypillisten vaikutusten lisäksi) (3-5). Sitä vastoin veratridiinin ja akonitiinin toimintaa voidaan parhaiten kuvata osittaisena agonismina ja kanavan toiminnan estona (5). Huolimatta rakennebiologian viimeaikaisista oivalluksista prokaryoottisten NaV-kanavien kolmiulotteisesta arkkitehtuurista (6-9), molekulaarinen ymmärrys sivuston 2 toksiinien vaikutuksesta ionijohtumiseen ja ionisulkeutumiskinetiikkaan puuttuu. Toksiinien rakenne-aktiivisuustutkimukset yhdessä proteiinimutaatiokokeiden kanssa voivat ratkaista kanavan toiminnan dynaamiseen luonteeseen liittyviä kysymyksiä ja ohjata NaV:n aktiivisuuden pienimolekyylisten modulaattoreiden rationaalista suunnittelua (1). (-)-BTX:n (10) teho, sen historiallinen historia arkkityyppisenä pienimolekyylisenä site 2 -koettimena (4) ja sen vertaansa vailla olevat vaikutukset kanavan sulkemiseen tekevät siitä optimaalisen ”pääyhdisteen” tällaisiin tutkimuksiin.

(-)-BTX:n sitoutuminen NaV:iin muuttaa kanavan toiminnan jokaista osa-aluetta, mikä johtaa hyperpolarisoituneeseen siirtymään aktivaation jänniteriippuvuudessa, sekä nopean että hitaan inaktivoitumisen estoon, yksikanavaisen konduktanssin pienenemiseen ja ioniselektiivisyyden heikkenemiseen (3, 4). Tämän luonnontuotteen käyttökelpoisuus NaV-aktivaattorina on johtanut siihen, että maailman varastot, jotka olivat aikoinaan yli 1 g, ovat vähentyneet huomattavasti, mutta vuonna 2009 ne olivat alle 170 mg (11, 12). Sen jälkeen, kun Märki ja Witkop eristivät toksiinin ensimmäisen kerran vuonna 1963 Kolumbian pohjoisesta sademetsästä kerätyistä myrkkysammakoista (13), Phyllobates on sisällytetty uhanalaisten lajien luetteloon, joten luonnollisen (-)-BTX:n keräämistä tästä lähteestä on rajoitettu. (-)-BTX:ää on tunnistettu myös tietyistä lintulajeista (Pitohui- ja Ifrita-suvusta) (14) ja kovakuoriaisista (Choresine-suvusta) (15), mutta vain pieniä määriä (esim. ~1,8 μg (-)-BTX:ää kovakuoriaista kohti). Vaikka BTX-A:n (kuva 1C), yhdisteen, josta puuttuu C-20-pyrroliesteri, puoli- (16) ja raseeminen synteesi (17) on julkistettu, näiden töiden pituus (>45 lineaarista vaihetta) estää (-)-BTX:n tai valittujen analogien helpon tuotannon. Näin ollen halumme käyttää BTX:ää ja sen modifioituja muotoja kanavien dynamiikan ja ionisulkumekanismien tutkimiseen on motivoinut pyrkimyksiämme saada luonnontuote de novo -synteesin avulla.

(-)-BTX:n retrosynteettinen analyysi johti meidät hahmottelemaan suunnitelman, joka mahdollistaisi homomorfoliinin E-kehän myöhäisen kokoonpanon ja C-20-alliyyliesterin laatimisen (kuva 1C), mikä helpottaisi toksiinin modifioitujen muotojen saantia. Aiemmat rakenne-aktiivisuussuhdetutkimukset, joissa käytettiin pientä määrää puolisynteettisiä BTX-johdannaisia (10, 18) ja C/D/E-renkaan BTX-analogeja (19), paljastivat C-20-esterin, tertiäärisen amiinin ja tetrasyklisen luurangon merkityksen NaV-agonistin aktiivisuudelle. BTX-A:n purkaminen paljastaa steroidin kaltaisen rungon 1, jonka kokoonpanoa häiritsevät kaksi C/D-renkaan liitoskohdassa olevaa kulmaryhmää, C-11-exo-metyleeni ja C-8/C-9-aleeni. Maksimoidaksemme synteettisen suunnitelmamme konvergenssin, suunnittelimme 1:n irrottamisstrategian C-renkaan poikki. Tämä ajatus vähentäisi ongelmaa 1:n rakentamisesta kahdeksi fragmentiksi, joista toinen ilmentäisi A/B-rengasjärjestelmää (3, 20) ja toinen sisältäisi D-renkaan syklopentaanin (4, 21). Tämän suunnitelman onnistunut toteuttaminen voisi tuottaa halutun toksiinin lineaaristen vaiheiden sekvenssillä, jonka yhteenlaskettu määrä on enintään 20-25.

(-)-BTX:n synteesimme alkoi metyleenisyklopentanonin 4 (21) (kuva S1A) ja vinyylibromidin 3 kytkennällä, joka saatiin (S)-(+)-Hajos-Parrish-ketonista muunnetulla vaiheiden sekvenssillä, joka oli alunperin hahmoteltu Parsonsin ja kumppaneiden toimesta (20) (kuva S1B). Fragmenttien 3 ja 4 yhdistäminen toisiinsa yhdistetyn A/B/D-kolmipyörän 5 tuottamiseksi oli ensimmäinen haaste prosessin kehittämisessä. Ensimmäisessä yrityksessä tämä muunnos toteutettiin vaihtamalla 3:n Li-Br n-BuLi:llä (Bu, butyyli) ja lisäämällä enoni 4 peräkkäin. Vaikka 5 saatiin aikaan näissä olosuhteissa, tuotteen saanto ei koskaan ylittänyt 30 prosenttia. Deuteriumin sammutuskokeet D2O:lla vahvistivat hypoteesimme, jonka mukaan 4:n α-deprotonaatio oli kilpailukykyinen halutun ketonien lisäysreitin kanssa. Vinyylilitiumlajien transmetalaatioreaktioita tutkittiin ZnCl2:n, ZnBr2:n, MgBr2-OEt2:n (Et, etyyli), CeCl3:n, Yb(OTf)3:n (Tf, trifluorimetansulfonaatti), CeCl3-2LiCl:n ja LaCl3-2LiCl:n kanssa, mutta mikään näistä toimenpiteistä ei osoittautunut tehokkaaksi (22, 23). Yhden ekvivalentin vedettömän LiBr:n lisääminen 3:n reaktioympäristöön paransi kytkennän tehokkuutta >20 % (24). Tätä johtolankaa seuraten optimoidulla protokollalla, jossa käytettiin 2,1 ekvivalenttia t-BuLi:tä, joka oletettavasti tuottaa yhden ekvivalentin LiBr:ää in situ, saatiin toistettavasti 5 yhdeksi diastereomeeriksi 65 %:n saannolla monen gramman mittakaavassa. Tämän materiaalin ja sen desilyloidun muodon 6 synteesin helppous mahdollisti myöhemmät pyrkimykset tunnistaa olosuhteet C-renkaan tandem-annulaatiolle ja kvaternaarisen C-13-keskuksen asentamiselle.

1,6-eenien rengassulkemisessa käytettävissä olevien menetelmien arviointi johti meidät harkitsemaan radikaalien käynnistämiä prosesseja (25). Tällaisissa olosuhteissa alkava C-13 3° -radikaali voitaisiin siepata kulmikkaan aminometyleeniyksikön (tai sopivan korvikkeen) muodostamiseksi. Pyrkimykset tutkia ensin C-renkaan muodostumista 6:sta paljastivat kuitenkin tämän suunnitelman mahdollisen virheellisyyden. Käyttämällä n-Bu3SnH:ta ja trietyyliboraania (Et3B) syklisoitumistapahtuman edistämiseksi saatiin aikaan kaksi isomeeria, 7 ja 8, suhteessa 1:5, mikä suosi ei-toivottua tuotetta (kuva 2A). Storkin, Beckwithin ja työtovereiden tutkimukset ovat osoittaneet, että substraattikonsentraatio ja reaktiolämpötila voivat vaikuttaa syklisoitumistapaan (eli 5-exo-trig vs. 6-endo-trig) radikaalivälitteisissä enyynireaktioissa (26, 27). Korotetussa lämpötilassa (130 °C) ja 6:n viisinkertaisella laimennuksella havaittiin selektiivisyyden kääntyminen, jolloin haluttua tetrasykliä saatiin hieman liikaa (7:8:n suhde 1,3:1; kuva 2A). Tämän muunnoksen yhteenlaskettu tuotetuotto ylitti 90 %, mikä rohkaisee tutkimaan tätä kemiaa edelleen vaatimattomista selektiivisyystuloksista huolimatta.

Kerratut yritykset vangita välituotteen C-13-radikaali oksiimi- ja hydratsonijohdannaisilla, jotka on tuotettu formaldehydistä, eivät johtaneet odotettuun aminometylaatiotuotteeseen (28). Kun jouduimme pohtimaan vaihtoehtoisia ratkaisuja, totesimme, että viereisestä C-14-alkoholista liitetty modifioitu silyylieetteriryhmä olisi sopivasti sijoitettu sieppaamaan 3°-radikaali (29). Käytettävissä olevien ennakkotapausten perusteella valittiin alkynylisilyylikloridi, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, metyyli), modifioimaan C-14-alkoholi 6:ssa (30, kuva 2A). Tuloksena saadun silylieetterin (9) käsittely n-Bu3SnH:lla ja Et3B:llä 150 °C:ssa johti syklisoitumiskaskadiin, jonka tuloksena saatiin pentasykli 10 ainoana tuotteena (31). Protonien ydinmagneettisen resonanssin (1H NMR) havaitsemisen rajoissa tässä prosessissa ei syntynyt yhtään vastaavaa viisirunkoista C-renkaan isomeeria. Alustavat pyrkimyksemme ymmärtää C-14-substituenttiryhmien merkitystä reaktioselektiivisyyteen viittaavat siihen, että alkoholin silyylisuojaus (yhdessä kohonneiden reaktiolämpötilojen kanssa) suosii 6-endo-trig-renkaan sulkeutumista. Vaikka lisätutkimukset ovat perusteltuja näiden rakenneselektiivisyyttä koskevien tietojen arvioimiseksi, enyynisyklisaatiokaskadimme tarjoaa konvergentin lähestymistavan substituoitujen steroidirunkojen syntetisoimiseksi, ja sen pitäisi helpottaa pääsyä monenlaisiin tällaisiin yhdisteisiin.

Joko 6:sta tai 9:stä johdettujen radikaalisyklisaatiotuotteiden läheinen tarkastelu paljasti odottamattoman tuloksen, joka liittyy tuloksena syntyvän orgaanisen tannaanin rakenteen rakenteeseen (Kuva 2, A ja B). Alkiiniryhmän karbostannyloinnin pitäisi tuottaa vinyylitinatuotetta, kuten havaittiin 6:n reaktiossa. Kun 9:lle sovellettiin reaktio-olosuhteita, ainoaksi tuotteeksi muodostui odottamatta allyylistannaani 10, mikä tulos vahvistettiin sekä NMR- että röntgenkristallografialla. Allyylistannaani 10:n muodostuminen voidaan järkeistää mekanismilla, johon liittyy 1,4-H-atomin siirto välituotteena olevasta vinyyliradikaalista (32) (kuva 2B), ja tätä ehdotusta tukee deuteriumleimauskoe (kuva S5). Vaikka tämä tulos oli suunnittelematon, syklisoitumisreaktion tehokkuus ja selektiivisyys pakottivat päätöksemme edistää tätä materiaalia. Tulevaisuutta ajatellen allyylistannaaniryhmän monipuolisuuden pitäisi palvella tulevia pyrkimyksiä valmistaa C-rengas-modifioituja BTX:iä.

10:n saatavuus yhdeksässä vaiheessa Hajos-Parrish-ketonista mahdollisti huomattavien materiaalimäärien tuottamisen tavoitesynteesin loppuun saattamiseksi. 10:n siltaavan silyylieetterin irrottaminen onnistui ylimääräisellä n-Bu4NF:llä, jolloin paljastui dioliväliaine, joka sittemmin eteni 11:ksi 2-jodoksibentsoehappovälitteisen alkoholihapetuksen ja kemoselektiivisen vinyylisilaanin pilkkomisen avulla (57 %; kuva 2B). Aldehydin 11 muuntaminen klooriasetamidiksi 12 suoritettiin kolmivaiheisella yhden pullon sekvenssillä (16, 33). Homomorfolinamidirenkaan tehokas sulkeminen 12:sta NaOEt:llä (92 %) (17) tarjosi monipuolisen välituotteen sekä C- että D-renkaan yksiköiden modifiointia varten. Jälkimmäinen voitiin saavuttaa D-renkaan enolitriflaatin avulla, joka valmistettiin KN(SiMe3)2:lla ja PhNTf2:lla.

C-11α-alkoholin johdattaminen C-renkaan allyylistannaanista 13 oli yksi vaikeimmista haasteista BTX:ää koskevassa lähestymistavassamme (kuva 2B). Vaikka 13:n protodestannylointi vastaavan C-11-exo-metyleenisykloheksaanin tuottamiseksi onnistui rajoitetusti (34), kaikki myöhemmät yritykset hapettaa tämä yhdiste ketoniksi 15 (eli O3, OsO4 ja RuO4) eivät tuottaneet tuotetta. Kimin ja Fuchsin raportin innoittamana yritimme muuntaa 13 vastaavaksi allyylikloridiksi käyttämällä CuCl2:ta (35). Onneksi tämän reaktion toteuttaminen dioksaanissa aerobisissa olosuhteissa tuotti enaalia 14 85 %:n saannolla, jossa oli vain pieni määrä kloorattua tuotetta (~10 %). Vaikka tämän muunnoksen mekaaniset yksityiskohdat ovat edelleen epäselviä, tiedossamme on vain yksi toinen dokumentoitu esimerkki tällaisesta hapetusreaktiosta, jossa käytetään vanadiinikatalyyttiä ja O2:ta (36). Enal 14 soveltuu sopivasti muunnettavaksi C-11-ketoniksi 15 seuraamalla sarjaa funktionaalisten ryhmien välisiä muunnosvaiheita, jotka korostuvat Curtiusin uudelleenjärjestelyssä (37). Elinkelpoisen kromoforin puuttuminen batrachotoksiiniini A:sta (BTX-A) vaikeuttaa tämän materiaalin puhdistamista, minkä vuoksi 15:een johtavassa sekvenssissä C-3-metoksiasetaali vaihdettiin p-metoksifenetyylialkoholiin.

(-)-BTX:n hiilirungon täydentäminen saatiin aikaan palladium-katalysoidulla tributyyli(1-etoksivinyyli)tinin ristikytkennällä vinyylitriflaatiksi 15 (kuva 3A) (38). Syntyneen enolieetterin in situ-hydrolyysi 1 M oksaalihapolla tuotti enonia 16 (77 %). Laajan pelkistävien aineiden seulan jälkeen onnistui enoni 16:n stereoselektiivinen kokonaispelkistys 33 prosentin saannolla käsittelemällä sitä tuoreella AlH3:lla (39). Oletamme, että Lewis-basinen laktaami (tai pelkistetty muoto) toimii keskeisenä stereokontrolloivana elementtinä, sillä enoni 15:n käsittely vaihtoehtoisilla hydridipelkistimillä tuotti yksinomaan ei-toivottua C-11β-alkoholia. AlH3:n käyttö suosi myös oikean C-20-allyylialkoholiepimeerin muodostumista, mikä on stereokemiallinen tulos, joka voidaan järkeistää kelaatiokontrolliin vetoavan mallin avulla (38). AlH3-pelkistyksestä happamissa olosuhteissa saadun tuotteen suojauksen poisto tuotti (-)-BTX-A:ta 83 prosentin saannolla (17). Käyttämällä Tokuyaman, Dalyn ja Witkopin (-)-BTX-A:n asylaatioprotokollan muunnosta etyylikloroformiaatista ja 2,4-dimetyylipyrroli-3-karboksyylihaposta (10) valmistetulla sekoitetulla anhydridillä saatiin lopulta valmiiksi 2 mg (-)-BTX:n synteesi (79 %, kokonaistuotos 79 %, kokonaissaanto 0,25 %) 24:ssä askeleessa (S)-(+)-Hajos-Parishin ketonista. Tuote oli kaikilta osin identtinen luonnollisesta aineesta otetun näytteen ja aiemmin kirjattujen spektroskooppisten tietojen kanssa (40, 41). Synteesisuunnitelmamme mahdollisti myös luonnottoman toksiinin antipodin, (+)-BTX:n, (-)-BTX-A:n tunnetun bentsoaattiesterin (BTX-B; kuva 3B) (42, 43) ja tämän yhdisteen enantiomeerin (ent-BTX-B) valmistamisen milligrammamittakaavassa.

Synteettisen (-)-BTX:n ja BTX-B:n elektrofysiologinen karakterisointi rotan NaV1.4:ää (rNaV1.4) vastaan vahvisti, että jälkimmäinen toimii myös agonistina ja että sen teho on samankaltainen kuin luonnontuotteen (kuva S6 ja taulukko S12). Aiemmat raportit ja omat tutkimuksemme osoittavat, että BTX-B:n esteriryhmä on vakaampi kuin BTX:n hapettumisherkkä asyylipyrroli, joten lisäkokeita tehtiin ensin mainitulla yhdisteellä (42, 43). Synteettistä BTX-B:tä testattiin edustavien NaV-isoformien osajoukkoa vastaan, mukaan lukien rNaV1.4, ihmisen NaV1.5 ja ihmisen NaV1.7. 10 μM BTX-B:n käyttö kiinalaisen hamsterin munasarjasoluihin, jotka ilmentävät yhtä NaV-alatyyppiä, johti kaikissa tapauksissa kestävään natriumvirtaan (kuva 4A ja kuvat S7 ja S8). NaV-isoformien käyttöriippuvainen agonismi BTX-B:llä esti >80 %:n natriumkanavapopulaation vakaan tilan inaktivaation (Kuva 4A ja kuva S8). BTX-B aiheutti myös tyypillisen hyperpolarisoivan siirtymän (-44,9 – -51,5 mV) villityyppisten NaV-isoformien aktivaation puolimaksimijännitteessä (V0,5) (Kuva 4B ja taulukko S13). Näiden tietojen samankaltaisuus on sopusoinnussa NaV:n alatyyppien välisen korkean proteiinisekvenssikonservaation kanssa sisäistä huokosta reunustavissa S6-heliksissä, jotka muodostavat oletetun toksiinin sitoutumiskohdan (kuva S9).

Laboratoriomme (19) ja muiden (44, 45) aikaisempien töiden perusteella kysyimme, sitoutuisiko BTX:n enantiomeerimuoto suurella affiniteetilla NaV:hen analogisilla toiminnallisilla vaikutuksilla. Tällaiseen kysymykseen voidaan vastata vain, jos käytettävissä on toksiinin de novo -synteesi. Näin ollen elektrofysiologiset rekisteröinnit ent-BTX-B:llä tehtiin rNaV1.4:ää vastaan. Nämä tiedot paljastivat, että ent-BTX-B on käyttö- ja tilariippuvainen kanavaantagonisti, jonka mitattu puolimaksimaalinen inhiboiva pitoisuus on 5,3 ± 0,6 μM . NaV:n puolimaksimaalisen eston konsentraatio ent-BTX-B: llä on samansuuruinen kuin BTX-B-agonismin puolimaksimaalinen tehokas konsentraatio (1,0 ± 0,1 μM; kuva S10), joka on mitattu identtisissä olosuhteissa. Huomionarvoista on, että toisin kuin luonnollinen antipodi, ent-BTX-B:n sitoutuminen aiheutti vain minimaalisen muutoksen aktivoitumisen V0.5:ssä ja vakaan tilan inaktivoitumisen V0.5:ssä (taulukko S14). Lisäksi kanavan esto oli täysin palautuva tällä inhibiittorilla.

Mutta sen määrittämiseksi, onko BTX-B:llä ja ent-BTX-B:llä yhteinen päällekkäinen sitoutumiskohta NaV:n sisemmän huokosen alueella, ent-BTX-B:tä testattiin viittä rNaV1.4:n yksipistemutanttia vasten, jotka ovat aiemmin osoittaneet estävänsä BTX:n sitoutumista (Kuva 4, E ja F ja kuva S12) (19). N434:n (46), L1280:n (47), F1579:n (48) ja N1584:n (48) mutaatio lysiiniksi johti siihen, että virran esto 5 μM ent-BTX-B:llä väheni ~3- 30-kertaisesti. F1236K:ta (49) vastaan ent-BTX-B säilytti kuitenkin merkittävän aktiivisuuden (33,6 ± 2,1 % virran esto). Ilmeinen ero ent-BTX-B:n ja BTX-B:n välillä osoittaa päällekkäisen, mutta ei-identtisen sitoutumisalueen sisäisen huokosontelon sisällä. Näyttäisi siltä, että avoin kanava on riittävän suuri, jotta siihen mahtuu lipofiilisiä tertiäärisiä amiiniligandeja (19, 45, 50). Hienovaraiset muutokset näiden ligandien sitoutumisasennossa näyttävät muuttavan dramaattisesti proteiinin toiminnallista vastetta. Tulevissa tutkimuksissa pyritään hahmottamaan tarkat kanavan ja toksiinin väliset vuorovaikutukset, jotka erottavat BTX-johdannaisten ja vastaavien lipofiilisten toksiinien aiheuttaman aktivaation ja eston toisistaan.