FOOD MICROBIOLOGY
Isolation of bacteriocin-tuottavien maitohappobakteerien eristäminen lihasta ja lihatuotteista ja sen inhiboivan aktiivisuuden kirjo
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inibitória
Renata Bromberg; Izildinha Moreno; Cíntia Lopes Zaganini; Roberta Regina Delboni; Josiane de Oliveira
Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas, SP, Brasil
Kirjeenvaihto
LÄHTEET
LÄHTEET
SANATIET
Kokonaisuudessaan 285:stä lihanäytteestä ja lihavalmisteesta arvioitiin bakteerikobakteereita tuottavien maitohappobakteereiden esiintyminen voileipäkokeella. Näistä näytteistä 174:stä eristettiin 813 maitohappobakteerikantaa. Ne pystyivät estämään Staphylococcus aureus CTC 33:n ja/tai Listeria innocua Lin 11:n kasvua. Well-diffuusiomäärityksellä arvioituna 128 näistä kannoista esti indikaattorikantojen kasvun. Isolaattien inhibitiospektrit arvioitiin erilaisia grampositiivisia ja gramnegatiivisia testieliöitä vastaan. S. aureus oli herkin testattu indikaattorikanta, kun taas Enterococcus faecalis ja Lactobacillus plantarum olivat vastustuskykyisimpiä. Jotkin proteolyyttiset entsyymit inaktivoivat kaikki maitohappobakteerien tuottamat yhdisteet kokonaan tai osittain, mikä osoittaa niiden proteiinipitoisen luonteen. Tässä työssä eristettyjen maitohappobakteerien tuottamien bakteeriosiinien antimikrobinen aktiivisuus voisi toimia potentiaalisena esteenä pilaantumisbakteerien ja elintarvikepatogeenien kasvun estämiseksi.
Key words: bacteriocins, lact acid bacteria, meat, inhibitory activity.
RESUMO
Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do ”sanduíche”. Näistä näytteistä 174:stä eristettiin 813 maitohappobakteerikantaa, joilla oli inhiboiva vaikutus Staphylococcus aureus CTC 033:een ja/tai Listeria innocua Lin 11:een. Kun kantoja tutkittiin samanaikaisen antagonismin menetelmällä kuopissa, 128 näistä kannoista esti indikaattorimikro-organismien kasvun. Eristettyjen kantojen aktiivisuusspektri arvioitiin erilaisilla grampositiivisilla ja gramnegatiivisilla mikro-organismeilla. Yleisesti ottaen S. aureus oli herkin indikaattorimikro-organismi, kun taas Enterococcus faecalis ja Lactobacillus plantarum olivat vastustuskykyisimpiä. Proteolyyttiset entsyymit inaktivoivat kokonaan tai osittain kaikki testattujen maitohappobakteerien tuottamat antimikrobiset yhdisteet, mikä osoittaa niiden proteiiniluonnetta. Tässä työssä eristettyjen maitohappobakteerikantojen tuottamien bakteeriosiinien antimikrobinen aktiivisuus voi toimia potentiaalisena esteenä pilaantumisalttiiden ja elintarvikeperäisten patogeenisten bakteerien kasvun estämiseksi.
Palavras-chave: bactérias lácticas, bacteriocinas, carne, atividade inibitória.
INTRODUCTION
Viime aikoina on yritetty soveltaa biosäilytystekniikoita lihatuotteisiin (18). Näihin on kuulunut kilpailukykyisen maitohappobakteeriflooran tuominen lihavalmisteiden suojaviljelmiksi, mukaan lukien bakteeriosiinia tuottavat maitohappobakteerit ja puhdistetut anti-listeriaaliset bakteeriosiinit (12). Koska bakteeriosiinia tuottavia bakteereja on eristetty elintarvikkeista, jotka normaalisti sisältävät maitohappobakteereja, kuten lihasta ja maitotuotteista, niitä on käytetty jo pitkään. Maitohappobakteerien tuottamat bakteriosiinit määritellään solunulkoisesti tuotetuiksi bakteerien ribosomaalisynteesin primäärisiksi tai muunnetuiksi tuotteiksi, joilla voi olla suhteellisen kapea bakterisidinen aktiivisuus (4). Bakteeriosiinia tuottavia kantoja voidaan käyttää fermentoitujen elintarvikkeiden käynnistysviljelmien osana tai lisänä turvallisuuden ja laadun parantamiseksi. Tässä yhteydessä lihaan liittyvien maitohappobakteerien, kuten Pediococcus-, Leuconostoc-, Carnobacterium- ja Lactobacillus-suvun kaltaisten bakteerien tuottamat bakteeriosiinit ovat todennäköisesti paljon potentiaalisempia lihan säilöntäaineita (3,31,33,38). Bakteeriosiinien hyödyntäminen elintarvikkeiden fermentoinnissa on mahdollista silloin, kun inhibitiospektriin kuuluu elintarvikkeita pilaavia ja/tai patogeenisiä mikro-organismeja, mikä antaa tuottavalle kannalle kilpailuedun elintarvikkeessa. Bakteriosiinien tärkeä etu klassisiin antibiootteihin verrattuna on se, että ruoansulatusentsyymit tuhoavat ne (4). Tämä osoittaa, että näiden yhdisteiden nauttiminen ei muuta ruoansulatuskanavan ekologiaa eikä aiheuta tavanomaisten antibioottien käyttöön liittyviä riskejä.
Bakteeriosineja voitaisiin soveltaa hurrikaaniteknologiassa, jossa hyödynnetään yhdistelmähoitojen synergiaetuja elintarvikkeiden säilyttämiseksi tehokkaammin (6). Lactococcus lactis ssp. -bakteerin tuottaman nisiinin käyttö on tällä hetkellä sallittua noin 50 maassa. Eräät tutkijat ovat kuitenkin todenneet, että nisiini ei ole tehokas lihan käsittelyssä, koska sen pH-arvo on korkea (24), bakteeriosiinia on vaikea levittää tasaisesti koko elintarvikkeeseen ja koska lihan ainesosat, kuten fosfolipidit (8) ja glutationi (26), häiritsevät sitä. Koska nisiinin käyttö lihassa on vaikeaa, uusien bakteeriosiinia tuottavien viljelmien etsintää olisi jatkettava.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli seuloa erilaisia lihoja ja lihatuotteita sellaisten bakteeriosiinia tuottavien kantojen esiintymisen varalta, jotka saattaisivat olla arvokkaita käytettäväksi lihatuotteiden biosäilytysstrategioissa. Siten arvioitiin isolaattien potentiaalia estää elintarvikkeiden pilaantumista aiheuttavia ja elintarvikkeiden välityksellä tarttuvia patogeenisiä bakteereja.
MATERIAALIT JA MENETELMÄT
Bakteerikannat ja kasvualustat
Taulukossa 1 on lueteltu tässä tutkimuksessa käytetyt kannat. Indikaattoreiksi valitut bakteerit olivat Staphylococcus aureus CTC 33 (Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Campinas, Brasilia), Listeria innocua Lin 11 (Pasteur Institute, Pariisi, Ranska) ja Bacillus cereus CTC 1 (ITAL). Positiivisena kontrollina käytettiin bakteeriosiinia tuottavaa Lactobacillus casei LC 705:tä (Wiesby). Maitohappobakteerien ja muiden mikro-organismien kantaviljelmiä pidettiin -80ºC:ssa de Man Rogosa Sharpe -liemessä (MRS, Oxoid Ltd., Basingstoke, Yhdistynyt kuningaskunta) tai Trypticase Soya -liemessä (TSB, Oxoid), jota oli täydennetty 15 % glyserolilla. Työviljelmät valmistettiin MRS-agarille maitohappobakteerien osalta tai TSA-agarille, johon oli lisätty 0,6 % hiivauutetta (Oxoid) indikaattoreiden osalta, ja ne säilytettiin 4 ºC:ssa. Viljelmät kokeita varten raidoitettiin kerran viikossa ja inokuloitiin väliaineeseen yhdestä pesäkkeestä ja inkuboitiin 24 h. Ennen käyttöä maitohappobakteeriviljelmät siirrettiin kahdesti sopivaan väliaineeseen ja inkuboitiin taulukossa 1 esitettyjen olosuhteiden mukaisesti.
Näytteet
Analysoitiin kaksisataa kahdeksankymmentäviisi näytettä erilaisista brasilialaisilta valmistajilta saaduista erilaisista lihoista ja lihavalmisteista. Näytteisiin sisältyi tuoretta lihaa, raakaa, kypsennettyä, kypsytettyä, kuivattua tai fermentoitua lihavalmistetta. Vähittäismarkkinoilta ostamisen jälkeen kaikki näytteet säilytettiin 3 ± 1ºC:ssa enintään 24 tuntia ennen analysointia.
Bakteriosiinia tuottavien maitohappobakteerien eristäminen lihasta
Kustakin lihanäytteestä siirrettiin aseptisesti 25 g:n annos steriiliin stomacher-pussiin ja lisättiin 225 ml puskuroitua peptonivettä (Buffered Peptone Water, BPW, Oxoid), jotta saatiin laimennus 1:10. Näytteitä sekoitettiin 1 minuutin ajan stomacherilla (Model 400 – BA 7021, Seward Medical, London, UK). Näytteistä tehtiin sarjalaimennokset 0,1-prosenttiseen peptoniveteen. Antagonistisen aktiivisuuden havaitsemiseksi käytettiin ”sandwich”-testiä (37). Tätä tarkoitusta varten laimennokset inokuloitiin (kaatoalusta) MRS-agarille, johon oli lisätty 0,01 % natriumatsidia gramnegatiivisten bakteerien inhiboimiseksi. Vetyperoksidin inhiboiva vaikutus poistettiin lisäämällä katalaasia (Sigma Chemical Co., Dorset, Yhdistynyt kuningaskunta) loppupitoisuutena 100 U. Orgaanisten happojen tuotannon aiheuttamasta pH:n alenemisesta johtuvan inhiboinnin poissulkemiseksi MRS-agariin lisättiin 2 %:sta natrium-b-glyserofosfaattia (Ecibra, Brasilia). Levyt päällystettiin samalla väliaineella, jotta voitiin sulkea pois lytisten bakteriofagien aiheuttama inhibitio, sillä lytiset bakteriofagit eivät ole hajottavia yksiköitä, minkä jälkeen levyjä inkuboitiin aerobisesti 35 ºC:ssa 48 tuntia, jotta pesäkkeet kehittyisivät.
Inkubaatioajan jälkeen levyt, jotka sisälsivät enintään 102 CFU:ta, peitettiin 4,5 ml:lla pehmeää TSB:tä (joka sisälsi 0,75 % agaria). Päällystettyyn agariin kylvettiin 500 ml S. aureus CTC 33:ta tai L. innocua Lin 11:tä tasolla 106-107 CFU/ml. Levyjä inkuboitiin 35 ºC:ssa 24 tuntia. Indikaattorikantojen lyysi johti selkeään vyöhykkeeseen. Pesäkkeet, joissa esiintyi inhibitiovyöhykkeitä, siirrettiin TSB-levylle ja inkuboitiin 30 ºC:ssa enintään 72 h. Viljelmät puhdistettiin MRS-agarlevyille ja inkuboitiin 30 ºC:ssa 18 h. Puhdistetut isolaatit tutkittiin Gram-värjäyksellä ja katalaasituotannolla, joka määritettiin Harriganin ja McCancen (10) mukaisesti.
Antagonistisen aktiivisuuden osoittaminen
Lihasta ja lihatuotteista eristettyjen maitohappobakteerien bakteerituotanto määritettiin agar-kuoppadiffuusiomenetelmällä Benkerroumin ym. mukaan (1), joka on Taggin ja McGivenin (35) kuvaaman menetelmän muunnos. Levyjä tutkittiin lyysin havaitsemiseksi kuoppien ympärillä eri aikaväleillä yhteensä 24 tunnin ajan. Eri kantojen tuottamien inhibitiovyöhykkeiden halkaisijoita verrattiin suoraan.
Bakteriosiinien inhibitiospektri
Lihasta ja lihatuotteista eristettyjä bakteriosiinia tuottavia viljelmiä testattiin myös taulukossa 1 esitettyjä bakteerikantoja vastaan. Well-diffuusiomääritystä käytettiin edellä kuvatulla tavalla. Kannat, jotka osoittivat laajaa aktiivisuusspektriä, testattiin myös Mayr-Hartingin ym. kriittisellä laimennusmäärityksellä (19). Otsikko määriteltiin suurimman indikaattorikannan inhibitiota osoittavan laimennoksen käänteisarvona kerrottuna 100:lla, jotta tulokset voidaan ilmaista aktiivisuusyksikköinä millilitraa kohti (AU/ml).
Bakteriosiinien kaltaisen aineen herkkyys entsyymeille
Maitohappoviljelmien soluvapaat supernatantit kerättiin sentrifugoimalla (7500 g, 10 min, 4 ºC) yön yli kestäneitä MRS-liemiviljelmiä. Supernatanttinesteet säädettiin pH-arvoon 6,5 10 N NaOH:lla ja altistettiin kuumuudelle (95ºC 5 minuutin ajan) kiehuvassa vesihauteessa. Supernatanttia käsiteltiin seuraavilla entsyymeillä, joiden lopullinen pitoisuus oli 0,2 mg/ml: fisiini (Sigma Chemical Co., Dorset, Englanti) 20 mM natriumfosfaatissa, pH 7,0; trypsiini (Sigma) 40 mM Tris-HCl:ssä, pH 8,2; a-kymotrypsiini (Sigma) 20 mM Tris-HCl:ssä, pH 8,0; pronaasi E (Sigma) 20 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,0; pronaasi E (Sigma) 20 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,0.8; pepsiini (Merck Darmstad, Saksa)0,002 N HCl:ssä; lipaasi (Merck) 0,1 M kaliumfosfaatissa, pH 6,0; papaiini (Sigma) 0,05 M natriumfosfaattiasetaatissa, pH 7,0. Kaikki nämä liuokset steriloitiin suodattamalla Millex GV 0,22 m -suodattimien (Millipore S.A., St. Quentin-en-Yvelines, Ranska) läpi ja lisättiin sitten steriileihin soluvapaisiin supernatantteihin (v/v, 1/1). Kontrollit koostuivat entsyymiliuoksista ilman bakteeriosiinia ja ainoastaan 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa olevasta soluvapaasta supernatantista. Näytteitä ja kontrolleja inkuboitiin 37 ºC:ssa 2 tuntia ja kuumennettiin kiehuvassa vedessä 5 minuuttia entsyymien inaktivoimiseksi. Jäljellä oleva bakteeriosiiniaktiivisuus määritettiin Mayr-Hartingin ym. (19) kriittisellä laimennusmäärityksellä edellä kuvatulla tavalla käyttäen B. cereus CTC 1:tä indikaattorikantana.
TULOKSET JA KESKUSTELU
Bakteerien eristäminen ja seulonta
Koska lihasta ja tuotteista eristetyt bakteeriosiinia tuottavat bakteerit ovat hyvin sopeutuneet näihin olosuhteisiin, ne voisivat varmistaa näiden elintarvikkeiden turvallisuuden ja pidentää niiden säilyvyyttä. Tämän vuoksi eri lihasta ja lihavalmisteista eristetyistä bakteereista etsittiin antagonistisia ominaisuuksia elintarvikkeiden pilaantumista aiheuttavia ja patogeenisiä bakteereja vastaan.
Tulosten mukaan yhteensä 285:stä analysoidusta tuoreesta liha- ja lihatuotenäytteestä 174:ssä esiintyi maitohappobakteerikantoja, joiden todettiin tuottavan bakteeriosiinin kaltaisia aineita ”sandwich”-testillä. Kustakin näytteestä eristettiin vähintään 4 pesäkettä, jotka kykenivät estämään S. aureus CTC 33:n ja/tai L. innocua Lin 11:n toimintaa, eli yhteensä 813 pesäkettä. De Martinis et al. (7) seuloivat 20 brasilialaista liha- ja lihatuotenäytettä ja eristivät neljä bakteeriosiinia tuottavaa maitohappobakteeria, joilla oli antilisteriaalista vaikutusta.
Puhdistuksen jälkeen viljelmät tarkistettiin bakteeriosiinituotannon osalta well-diffuusiomäärityksellä. Tätä menetelmää käyttämällä, inokuloimalla kuoppiin eri indikaattorimikro-organismien liemiviljelmiä, voidaan vertailla eri kantojen bakteeriosiinituotantoa, jotka kasvavat samanlaisissa olosuhteissa. 813 isolaatista vain 128 (15,7 %) tuotti inhibitiovyöhykkeitä MRS-agarilla. Nämä bakteeriosiinia tuottavat kannat olivat kaikki grampositiivisia ja katalaasinegatiivisia, 75,8 prosenttia oli kokkeja ja 24,2 prosenttia sauvoja. Schillinger ja Lücke (28) saivat samankaltaisia tuloksia tarkastellessaan Lactobacillus sake -kantoja, jotka olivat positiivisia agar-pistokokeessa ja negatiivisia well-diffuusiomäärityksessä: yhteensä 19 kannasta vain kuusi tuotti inhibitiovyöhykkeitä agarille well-diffuusiomäärityksessä. Lewus et al. (16) havaitsivat, että vain muutamat niistä kannoista, jotka testattiin positiivisiksi spot-on-the-lawn -menetelmällä, antoivat positiivisen tuloksen well-diffusion-testissä. He katsoivat, että määrityksen herkkyyttä voitaisiin lisätä antamalla bakteeriosiinien diffundoitua agariin jonkin verran aikaa ennen inkubointia tai suurentamalla kuoppien kokoa, jotta näytettä voitaisiin käyttää enemmän. Kirjoittajien mukaan aggregaatio, bakteeriosiinien hajoamattomuus, proteaasin inaktivoituminen ja konsentraatiovaikutukset voivat kaikki johtaa vääriin negatiivisiin tuloksiin kuoppadiffuusiomäärityksessä.
Kaivodiffuusiomäärityksen tulokset osoittivat, että 64,1 % eristetyistä kannoista inhiboi vain S. aureusta ja 11,7 % osoitti inhiboivaa aktiivisuutta vain L. innocuaa vastaan, kun taas 24,2 % S. aureusta inhiboivista lihaeristeistä inhiboi myös L. innocuaa. Lewus et al. (16) mukaan alkuperäisessä seulonnassa käytetyn indikaattorimikro-organismin on vastattava bakteeriosiinia tuottavan kannan lopullista tai ehdotettua käyttötarkoitusta. S. aureus ja Listeria sp. esiintyvät usein tuoreissa kudoksissa, koska teurastusprosessiin ei sisälly bakteerien tuhoamisvaihetta. S. aureuksen kasvu elintarvikkeissa on potentiaalinen kansanterveysriski, koska monet S. aureuskannat tuottavat enterotoksiineja, jotka aiheuttavat ruokamyrkytyksen, jos niitä nautitaan. Liha ja lihavalmisteet yhdistetään yleisesti stafylokokin aiheuttamiin ruokamyrkytyksiin (25,36). Listerialajeja on löydetty lihasta ja lihavalmisteista (13). L. monocytogenes -bakteerin tarttuminen elintarvikkeiden välityksellä on ollut osallisena ihmisillä esiintyneissä listerioositapauksissa, joihin on liittynyt erilaisten elintarvikkeiden nauttimista (9,17,29). L. innocua eristetään usein lihasta, ja usein tämän organismin esiintyvyys on suurempi kuin L. monocytogenesin (2). On ehdotettu muiden Listeria-lajien kuin L. monocytogenesin käyttöä tämän organismin esiintymisen indikaattoreina (39).
Kuvassa 1 esitetään liha- ja lihatuotenäytteiden ryhmät, joissa esiintyi bakteeriosiinin kaltaisia tuottavia maitohappobakteereja ”sandwich”-testin ja well-diffusion assay -testin mukaan. Kaikkia ”sandwich”-testillä eristettyjä bakteereja ei kuitenkaan vahvistettu well-diffuusiomäärityksessä. Sandwich-testi osoitti 174 (61,0 %) positiivista näytettä bakteeriosiinityyppisiä bakteereja tuottaville organismeille, joista vain 55 (31,1 %) osoittautui positiiviseksi well-diffuusiomäärityksessä. Sandwich-testin mukaan suurin osa bakteeriosiinia tuottavista bakteereista eristettiin kypsytetyistä, kuivatuista tai fermentoiduista lihatuotteista (78,4 %). Samaa ei havaittu well-diffuusiomäärityksessä: tuoreessa lihassa oli enemmän bakteeriosiinia tuottavia bakteereja (27,5 %). Toisaalta molemmat menetelmät osoittivat, että kypsennetyt lihatuotteet sisälsivät vähemmän näytteitä, joissa oli bakteeriosiinin kaltaisten aineiden suhteen positiivisia maitohappobakteereja.
Nämä negatiiviset tulokset voivat osoittaa, että bakteeriosiinituotanto ei ole kovin konservoitunutta näissä kannoissa. Jotkin bakteeriosiinit ovat plasmidivälitteisiä proteiineja (34), joten on otettava huomioon mahdollisuus, että jotkin viljelmät ovat voineet menettää plasmidinsa peräkkäisten siirtojen jälkeen puhdistuksen aikana.
Inhiboivan aktiivisuuden spektrit
Bakteeri-isolaattien tuottamien antibakteeristen yhdisteiden aktiivisuus 18 indikaattorikantaa vastaan on esitetty (taulukossa 2). Näillä kannoilla oli laaja inhibitiospektri, koska ne pystyivät inhiboimaan monia testatuista indikaattorikannoista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että bakteeriosiinien seulontatesteissä olisi käytettävä useita eri indikaattorimikro-organismeja, jottei tuottaja jäisi huomaamatta. Kaikista testatuista indikaattorikannoista S. aureus CTC 33, Cl. sporogenes CTC 6 ja B. cereus CTC 1 olivat herkimpiä, sillä ne estivät suurimman määrän viljelmiä, kun taas Ent. faecalis ATCC 19433, Lb. plantarum TECNOLAT 434, sulfiittia pelkistävät klostridit CTC 5, Leuc. mesenteroides ATCC 10830 ja W. viridescens CCT 849 estivät pienemmän määrän kantoja. Bakteeriosiinituotannon osalta testatuista kannoista yksikään ei osoittanut inhiboivaa aktiivisuutta kaikkia indikaattoreita vastaan. Vain neljä kantaa (CTC 165, CTC 376, CTC 469 ja CTC 484) estivät suurimman osan testatuista indikaattorikannoista (tietoja ei ole esitetty).
Suurin osa maitohappokantojen aiheuttamasta inhibitiosta tuotti ”matalia” inhibitiovyöhykkeitä (puhdistusvyöhykkeen säde oli alle 3 mm). Lb. helveticus (Wiesby) oli erittäin herkkä indikaattori, sillä 90,2 % tämän bakteerin osalta testattujen bakteerikiinien aiheuttamasta inhibitiosta tuotti ”korkeita” inhibitiovyöhykkeitä (puhdistusvyöhykkeen säde oli yli 5 mm). Viljelmät, jotka tuottivat ”korkeita” inhibitiovyöhykkeitä indikaattorikantoja vastaan, olivat: CTC 3, CTC 12, CTC 35, CTC 36, CTC 38, CTC 40, CTC 49, CTC 51, CTC 78, CTC 141, CTC 142, CTC 144, CTC 172, CTC 176, CTC 185, CTC 204, CTC 205, CTC 206, CTC 210, CTC 211, CTC 212, CTC 231, CTC 253, CTC 330, CTC 346, CTC 352, CTC 359, CTC 375, CTC 376, CTC 377, CTC 378, CTC 396, CTC 404, CTC 469, CTC 483, CTC 484 ja CTC 485 kilogrammaa vastaan. helveticus -bakteeria vastaan, kannat CTC 78 ja CTC 172 B. cereus CTC 001 -bakteeria vastaan, kanta CTC 172 Cl. sporogenes CTC 006 -bakteeria vastaan ja kanta CTC 332 Cl. perfringens CTC 42 -bakteeria vastaan.
Jotkut kannat tuottivat bakteriosiinityyppisiä aineita, jotka estivät testattuja gramnegatiivisia bakteereja: Pseudomonas sp. CTC 32 esti 61 (47,6 %) kantaa, E. coli ATCC 25422 49 (38,3 %) kantaa ja Salm. typhimurium ATCC 14028 48 (37,5 %) kantaa. Bakteeriosiinien kohteena on sytoplasmakalvo, joten gramnegatiivisten bakteerien ulkokalvon LPS:n muodostaman suojaesteen vuoksi bakteeriosiinit ovat yleensä aktiivisia vain grampositiivisia soluja vastaan (32). Gramnegatiivisten bakteerien mutanttikannoista tai protoplasteista tuli kuitenkin herkkiä bakteeriosiinien vaikutukselle, kun ne altistettiin sub-letaaliselle stressille, kuten kuumentamiselle, jäädyttämiselle tai sulattamiselle, jotka rikkovat ulomman kalvon ja mahdollistavat bakteeriosiinien pääsyn sytoplasmakalvoon, mikä johtaa herkkyyden lisääntymiseen (11,30,32).
Mikrobilääkeaktiivisuuden osalta testatuista 128 viljelmästä 12:ta, jotka estivät suurimman määrän indikaattoreita, testattiin Mayr-Hartingin ym. (19) määrityksellä (taulukko 3). Tulosten mukaan B. cereus CTC 1 ja L. monocytogenes CTC 21 olivat herkimmät testatut mikro-organismit, sillä analysoidut maitohappokannat inhiboivat 100 % ja 91,7 % niistä. Testattujen indikaattorikantojen inhibitioasteessa havaittiin vaihtelua. W. viridescens CCT 849 oli vastustuskykyisin, sillä sen aktiivisuusarvo oli alhaisin. B. cereus ATCC 14579, Leuc. mesenteroides ATCC 10830 ja sulfiittia pelkistävä klostridia CCT 5 osoittivat keskitason herkkyyttä, kun taas S. aureus CTC 33, L. innocua Lin 11, L. monocytogenes CTC 21 ja Cl. perfringens CTC 42 olivat vähemmän vastustuskykyisiä. Herkimmät mikro-organismit B. cereus CTC 1, Ent. faecalis ATCC 19433 ja Lb. helveticus (Wiesby) osoittivat suurinta herkkyyttä joitakin tuottajia vastaan. Tuottajista kannoilla CTC 210 ja CTC 404 oli alhaisemmat estoaktiivisuusarvot, kun taas kannoilla CTC 469, CTC 483 ja CTC 485 oli korkein aktiivisuus. Testatuista kannoista CTC 164 ja CTC 469 osoittivat laajimman aktiivisuusspektrin, sillä ne pystyivät estämään 44,4 prosenttia indikaattoriviljelmistä.
Jotkut mikro-organismeista, jotka osoittivat herkkyyttä hyvin diffuusiomäärityksellä testattuja kantoja kohtaan, kuten gramnegatiiviset lajit (E. coli ATCC 25422, Pseudomonas sp. CTC 32 ja Salm. typhimurium ATCC 14028), Cl. sporogenes CTC 6, Micrococcus sp. ATCC 4698, Lb. plantarum TECNOLAT 434 ja Streptococcus sp. ATCC 25175, eivät estyneet Mayr-Hartingin ym. (19) määrityksessä. Ainoastaan B. cereus CTC 1:llä oli sama herkkyys, kun sitä analysoitiin molemmilla menetelmillä.
Indikaattoriviljelmien inhibitio oli suurempi käytettäessä well-diffusion assay -menetelmää. Koska sekä tuottajaviljelmät että indikaattoriviljelmät kasvoivat samanaikaisesti, inhibitio saattoi johtua kilpailusta ravinteista elatusaineissa. Käyttämällä Mayr-Hartingin ym. (19) määrityksessä soluvapaita supernatantteja voitaisiin välttää tämä ongelma.
Herkkyys proteolyyttisille ja lipolyyttisille entsyymeille
Maitohappobakteerien tuottamien antibakteeristen aineiden herkkyys a-kymotrypsiinille, trypsiinille, pronaasi E:lle, fisiinille, pepsiinille, papaiinille ja lipaasille määritettiin kontrolloiduissa ja toistettavissa olosuhteissa, jotka on esitetty (taulukossa 4). Jotkin proteolyyttiset entsyymit inaktivoivat kaikki yhdisteet kokonaan tai osittain, mikä osoittaa niiden proteiinipitoisen luonteen.
Yleisesti näiden kantojen tuottamien inhiboivien yhdisteiden herkkyys oli erilainen. Kaikki niistä inaktivoituivat kokonaan a-kymotrypsiinillä, pronaasi E:llä ja fisiinillä. Vain yksi oli resistentti trypsiinille (kanta CTC 141), kun taas kannan CTC 204 tuottama aine menetti 75 % aktiivisuudestaan tämän entsyymin käsittelyn jälkeen. Jotkut kirjoittajat erottavat nisiinin muista laktokokkibakteerien bakteeriosiinista sillä, että a-kymotrypsiini on ainoa proteolyyttinen entsyymi, jolle nisiini on herkkä (14,22). Tähän ominaisuuteen on kuitenkin suhtauduttava varauksella, sillä muut kirjoittajat ovat raportoineet, että myös muut entsyymit, kuten pronaasi E (15,23) ja fisiini (5,21), voivat inaktivoida nisiinin.
Pepsiini esti 75 %:n kantojen (CTC 141, CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 396, CTC 404, CTC 483, CTC 484 ja CTC 485) antagonistisen aktiivisuuden. Herkkyyttä pepsiinille osoitettiin myös muilla bakteerikineillä: plantaarisiini 35d (20), sakasiini A (28) ja enterosiini 416KI (27). Papaiini ei vaikuttanut kantojen CTC 141 ja CTC 404 tuottamien antibakteeristen aineiden aktiivisuuteen, kun taas tämä entsyymi inaktivoi muut.
Kantojen CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 483, CTC 484 ja CTC 485 tuottamat yhdisteet inaktivoituivat kokonaan tai osittain sen jälkeen, kun ne oli käsitelty lipaasilla, mikä osoittaa, että näiden inhiboivien aineiden kemiallisessa koostumuksessa voi olla lipidiryhmä.
On mielenkiintoista huomata, että näiden kantojen tuottamat yhdisteet inaktivoitiin useilla proteolyyttisillä entsyymeillä, mukaan lukien haimaperäisillä (trypsiini ja a-kymotrypsiini) ja monesti mahalaukun entsyymeillä (pepsiini). Taggin ym. (34) ja Klaenhammerin (14) grampositiivisten bakteerien bakteeriyhdisteiden määritelmän ja maitohappobakteerien bakteeriyhdisteissä havaittujen ominaisuuksien (22) perusteella näiden kantojen tuottamat antibakteeriset yhdisteet voidaan luokitella bakteeriyhdisteiksi. Proteaasiherkkyyden malli osoittaa, että isolaattien tuottamat bakteeriosiinit ovat ainutlaatuisia ja että kannat ovat erilaisia. Vaikka joidenkin bakteeriosiinien proteaasiherkkyys oli samankaltainen, kuten CTC 210:n ja CTC 484:n tai CTC 352:n ja CTC 469:n välillä, niillä ei ollut samanlaista aktiivisuuden kirjoa.
Tulokset osoittivat, että 61 prosentissa analysoiduista lihanäytteistä esiintyi bakteeriosiinia tuottavia maitohappobakteereja, joilla on potentiaalia inhiboida haitallisia mikro-organismeja, kuten L. monocytogenes, S. aureus ja itiölliset bakteerit. Tässä tutkimuksessa eristettyjen maitohappobakteerien tuottamien bakteeriosiinien antimikrobinen aktiivisuus voisi toimia esteenä elintarvikkeiden pilaantumiselle ja/tai patogeenisten mikro-organismien kasvulle elintarvikkeissa. Jatkotyö näiden aineiden luonteen ja niiden soveltuvuuden arvioimiseksi lihan biosäilytystekniikoissa on käynnissä.
LÄHTEET
Tekijät kiittävät FAPESP:tä (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) taloudellisesta tuesta (Process 99/12314-0).
1. Benkerroum, N.; Ghouati, Y.; Sandine, W.E.; Tantaoui-Elaraki, A. Methods to demonstrate the bactericidal activity of bacteriocins. Letters Appl. Microbiol., 17: 80-81, 1993.
2. Breer, C.; Schopfer, K. Listeria ja elintarvikkeet. Lancet ii: 1022, 1988.
3. Campanini, M.; Pedrazzoni, I.; Barbuti, S.; Baldini, P. Behaviour of Listeria monocytogenes during the maturation of naturally and artificially contaminated salami: effect of lact acid bacteria starter cultures. Int. J. Food Microbiol, 20: 169-175, 1993.
4. Caplice, E.; Fitzgerald, G.F. Food fermentations: Role of microorganisms in food production and preservation. Int. J. Food Microbiol., 50(1-2): 131-149, 1999.
5. Carminati, D.; Giraffa, G.; Bossi, M. Bacteriocin-like inhibitors of Streptococcus lactis against Listeria monocytogenes. J. Food Prot., 52(9): 614-617, 1989.
6. Cleveland, J.; Montville, T.J.; Nes, I.F.; Chikindas, M.L. Bacteriocins: safe, natural, antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol, 71: 1-20, 2001.
7. De Martinis, E.C.P.; Públio, M.R.P.; Santarosa, P.R.; Freitas, F.Z. Antilisteriaalinen aktiivisuus brasilialaisista tyhjiöpakatuista brasilialaisista lihan antilihavalmisteista eristetyistä maitohappobakteereista. Braz. J. Microbiol., 32(1): 32-37, 2001.
8. De Vuyst, L.; Vandamme, E. Nisin, Lactococcus lactis subsp. lactis -organismin tuottama lantibiootti: ominaisuudet, biosynteesi ja sovellukset. In: De Vuyst, L.; Vandamme, E. (toim.). Bacteriocins of lact acid bacteria. Mikrobiologia, genetiikka ja sovellukset. Blackie Academic and Professional, Lontoo, 1994, s. 151-221.
9. Fleming, D.W.; Cochi, S.L.; MacDonald, K.L.; Brondum, J.; Hayes, P.S.; Plikaytis, B.D.; Holmes, M.B.; Audurier, A.; Broomer, C.V.; Reingold, A.L. Pasteuroitu maito tartunnan välikappaleena listerioosin puhkeamisessa. N. Engl. J. Med., 312: 404-407, 1985.
10. Harrigan, W.F.; McCance, M.E. Perusmenetelmät. In: Harrigan, W.F.; McCance, M.E. (toim.). Laboratory methods in food and dairy microbiology. Academic Press, Lontoo, 1976, s.1-115.
11. Hauben, K.; Wuytack, E.; Soontjens, C.C.F.; Michiels, C.W. High-pressure transient sensitization of Escherichia coli to lysozyme and nisin by disruption of outer-membrane permeability. J. Food Prot., 59: 350-355, 1996.
12. Hugas, M.; Monfort, J.M. Bakteerien käynnistysviljelmät lihan fermentointia varten. Food Chem., 59(4): 547-554, 1997.
13. Johnson, J.L.; Doyle, M.P.; Cassens, R.G. Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in meat and meat products. Katsaus. J. Food Prot., 53(1): 81-91, 1990.
14. Klaenhammer, T.R. Maitohappobakteerien bakteriosiinit. Biochimie, 70: 337-349, 1988.
15. Kojic, M.; Svircevic, J.; Banina, A.; Topisirovic, L. Bakteriosiinia tuottava kanta Lactococcus lactis subsp. diacitilactis S50. Appl. Environ. Microbiol., 57(6): 1835-1837, 1991.
16. Lewus, C.B.; Kaiser, A.; Montville, T.J. Elintarvikeperäisten patogeenien estäminen lihasta eristetyistä maitohappobakteereista peräisin olevilla bakteeriineilla. Appl. Environ. Microbiol., 57(6): 1683-1688, 1991.
17. N. Engl. J. Med., 319: 823-828, 1988.
18. Lücke, F-K. Mikrobien hyödyntäminen lihan käsittelyssä ja säilömisessä. Meat Sci., 56: 105-115, 2000.
19. Mayr-Harting, A.; Hedges, A.J.; Berkeley, C.W. Menetelmät bakteerikiinien tutkimiseksi. In: Norris, J.R.; Ribbons, D.W. (toim.). Methods in Microbiology. Academic Press Inc., New York, 1972, s. 316-422.
20. Messi, P.; Bondi, M.; Sabia, C.; Battini, R.; Manicardi, G. Lactobacillus plantarum -kannan tuottaman bakteeriosiinin (plantaarisiini 35d) toteaminen ja alustava karakterisointi. Int. J. Food Microbiol, 64: 193-198, 2001.
21. Moreno, I.; Lerayer, A.L.S.; Baldini, V.L.S.; Leitão, M.F.F. Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains. Braz. J. Microbiol., 31(3): 184-192, 2000.
22. Piard, J.C.; Desmazeaud, M. Maitohappobakteerien tuottamat inhibitiotekijät. 2. Bakteriosiinit ja muut antibakteeriset aineet. Lait, 72: 113-142, 1992.
23. Rammelsberg, M.; Radler, F. Lactobacillus-lajien antibakteeriset polypeptidit. J. Appl. Bacteriol., 69: 177-184, 1990.
24. Rayman, K.; Malik, N.; Hurst, A. Nisiinin epäonnistuminen Clostridium botulinum -bakteerin outgrowthin estämisessä kypsytetyn lihan mallijärjestelmässä. Appl. Environ. Microbiol., 46: 1450-1452, 1983.
25. Roberts, D. Kansanterveydellisesti merkittävät bakteerit. In: Brown, M.H. (toim.) Meat microbiology. Applied Science Publishers Ltd., Lontoo, 1982, s.319-386.
26. Rose, N.L.; Sporns, P.; Stiles, M.E.; McMullen, L.M. Inactivation of nisin by glutathione in fresh meat. J. Food Sci., 64(5): 759-762, 1999.
27. Sabia, C.; Manicardi, G.; Messi, P.; Niederhäusern, S.; Bondi, M. Enterocin 416K1, antilisteriaalinen bakteeriosiini, jota tuottaa italialaisista makkaroista eristetty Enterococcus casseliflavus IM 416K1. Int. J. Food Microbiol., 75: 163-170, 2002.
28. Schillinger, U.; Lücke, F-K. Lihasta eristettyjen Lactobacillus sake -bakteerien antibakteerinen aktiivisuus. Appl. Environ. Microbiol., 55(8): 1901-1906, 1989.
29. Schlech, W.F.; Lavigne, P.M.; Bortolussi, R.A.; Allen, A.C.; Haldane, E.V.; Wort, A.J.; Hightower, A.W.; Johnson, S.E.; King, S.H.; Nicholls, E.S.; Broome, C.V. Epidemian aiheuttama listerioosi – todisteet tartunnasta elintarvikkeiden välityksellä. N. Eng. J. Med., 308: 203-204, 1983.
30. Schved, F.; Henis, Y.; Juven, B.J. Gramnegatiivisten bakteerien sferoplastien ja kelaattoripermeabiloitujen solujen vaste bakteeripediosiini SJ-1:n ja nisiinin vaikutukseen. Int. J. Food Microbiol, 21: 305-314, 1994.
31. Shahidi, F. Vaihtoehtoisten lihankypsytysjärjestelmien kehittäminen. Trends Food Sci. Technol., 2: 219-222, 1991.
32. Stevens, K.A.; Sheldon, B.W.; Klapes, N.A.; Klaenhammer, T.R. Nisinikäsittely Salmonella-lajien ja muiden gramnegatiivisten bakteerien inaktivoimiseksi. Appl. Environ. Microbiol., 57: 3613-3615, 1991.
33. Stiles, M.E.; Hastings, J.W. Maitohappobakteerien bakteriosiinituotanto: Potential for use in meat preservation. Trends Food Sci. Technol., 2: 247-251, 1991.
34. Tagg, J.R.; Dajani, A.S.; Wannamaker, L.W. Gram-positiivisten bakteerien bakteriosiinit. Bacteriol. Rev., 40: 722-756, 1976.
35. Tagg, J.R.; McGiven, A.R. Bakteriosiinien määritysjärjestelmä. Appl. Microbiol., 21(5): 943, 1971.
36. Varnam, A.H.; Sutherland, J. Cooked cured cured lihat. In: Varnam, A.H.; Sutherland, J.P. (toim.). Meat and meat products. Teknologia, kemia ja mikrobiologia. Chapman & Hall, London, 1995, s.298-313.
37. Yang, R.; Ray, B. Prevalence and biological control of bacteriocin-producing psychrotrophic leuconostocs associated with spoilage of vacuum-packaged processed meats. J. Food Prot., 57(3): 209-217, 1994.
38. Yousef, A.E.; Luchansky, J.B.; Degnan, A.K.; Doyle, M.P. Listeria monocytogenes -bakteerin (Listeria monocytogenes) käyttäytyminen wieniläisissä ekssudaateissa Pediococcus acidilactici H:n tai pediosiini AcH:n läsnä ollessa säilytyksen aikana 4 tai 25 ºC:ssa. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1461-1467, 1991.
39. Maailman terveysjärjestön elintarvikevälitteistä listerioosia käsittelevä epävirallinen työryhmä. Foodborne listeriosis. Asiakirja nro WHO/WHE/FOS/88.5. Maailman terveysjärjestö: Geneve, Sveitsi, 1988.