TULOKSET JA KESKUSTELU
Vedenlaatuparametrit – lämpötila (28.2 ± 0,2ºC), liuennut happi % (107,4 ± 0,8), pH (7,9 ± 0,1), kokonaisammoniakkityppi (2,8 ± 0,0mg.L-1), ionisoimaton ammoniakki (0,004 ± 0,001mg.L-1) nitriittityppi (0.08 ± 0,01mg.L-1) ja nitraattityppi (1,19 ± 0,06mg.L-1) – pidettiin kalojen hyvinvoinnin ja luonnollisen kehityksen kannalta sopivina (Boyd, 1990).
Kromioksidi on laajimmin käytetty inertti merkkiaine eläimillä tehdyissä ravitsemustutkimuksissa, ja rehut mahdollistavat sen arvioinnin ja tasapainoisen ruokavalion täsmällisen laatimisen. Cr3+:n täydellinen talteenotto oksidimuodossa vahvistettiin radioaktiivisen isotooppitekniikan avulla (Kane et al., 1959, ja tästä syystä sitä käytettiin tässä tutkimuksessa 51Cr2O3:na (99,99 prosentin puhtausaste).
Tässä tutkimuksessa käytettiin 51Cr:ää mahdollisten virheiden välttämiseksi, jotka johtuvat kromin talteenotosta rehussa, akvaariovedessä, ulosteissa ja kalojen kudosnäytteissä, koska se mahdollistaa suoran, yksinkertaisen, herkän ja tarkemman alkuaineiden lukemisen näyteaineistosta vähentäen kemiallisiin analyyseihin liittyvää vääristymää erityisesti sulavuus- ja ravitsemustutkimuksissa. Kaikkia näitä tekijöitä seurattiin ja valvottiin huolellisesti tässä tutkimuksessa, joten tulokset voitiin lukea yksinomaan hoitovaikutusten ansioksi. Taulukossa 2 esitetään tulokset, keskihajonta ja regressioparametrit, jotka on määritetty kontrolli- ja koekaloista kerätyissä näytteissä havaittujen 51Cr:n spesifisten aktiivisuuksien logaritmisen muunnoksen jälkeen suhteessa keräysaikaan (päivinä). Regressioita verrattiin kulmakertoimien ja lineaaristen kertoimien avulla (Ostle ja Mensing, 1975).
Taulukko 2. Regressiot. Kontrolli- ja koekalojen näytekokoelmissa havaittujen 51Cr:n spesifisten aktiivisuuksien logaritminen muunnos ja ne, joita käytettiin regressiokäyrien säätämiseen.
| Kerätty näyte | Keruupäivä | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||
| Valvontakalat | |||||||||
| Blood (BC) | 1.00±0.01A | 1.00±0,01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | ||
| Kokeelliset kalat | |||||||||
| Blood (BE) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | ||
| Renaalinen kudos (RT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | ||
| Lihaskudos – Filee (MT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |||
| Maksakudos (LT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.00 | 1.00 ± 0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01 | 1.00±0.00 | 1.01±0.01 |
| Viskeraalinen rasva (VF) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | ||
| Suoli ilman sisältöä (I) | 1,06±0.04 | 1.19±0.05 | 1.30±0.05 | 1.49±0.12 | 1.82±0.03 | 1.89±0.0.27 | 2.22±0.11 | ||
| Vatsa ilman sisältöä (S) | 1.05±0.03 | 1.20±0.06 | 1.22±0.04 | 1.33±0.10 | 1.56±0.21 | 1.92±0.27 | 2.19±0.03 | ||
| Kylkiluiden kudos (GT) | 1.06±0.03 | 1.10±0.03 | 1.20±0.02 | 1.33±0.05 | 1.45±0.09 | 1.66±0.11 | 1.85±0.05 | ||
| Vesi akvaariosta (WA) | 1.04±0.06 | 1.27±0.04 | 1.48±0.03 | 1.62±0.04 | 1.74±0.03 | 1.83±0.03 | 1.87±0.06 | ||
| Ruuansulatuskanavan (ulosteen) sisältö (CTDE) | 1.18±0.08 | 1.81±0.38 | 2.60±0.28 | 3,75±0.24 | 4,26±0.31 | 5.07±0.15 | 5.83±0.04 | ||
AValeet ovat viiden toiston keskiarvoja (keskihajonta).
Tutkittaessa, tapahtuuko kaloissa kromi III:n imeytymistä, kuten kromioksidia, sovitettiin yksinkertaiset lineaariset regressiot – keräyspäivät vs. määräytymiskertoimet vertailukalojen ja koekalojen näytteille (kuvio 1). Tausta-arvot, jotka mitattiin kalojen kudosnäytteistä, jotka eivät saaneet koeruokavaliota, 10 000 laskentaa viidessä jaksossa, olivat keskimäärin 98,02±3,61cpm, ja ne vähennettiin kaikista kontrolli- ja koekalastusnäytteiden lukema-arvoista.
Kuva 1. Tausta-arvot. Kontrolli- ja koekalojen näytekokoelmien radioaktiivisen aktiivisuuden (cpm) estimaattien oikaistut lineaariset regressiot logaritmimuunnoksen jälkeen altistumisajan (päivien) funktiona.
Kolmiarvoisen kromin (esim. kloridien, fluoridien, fosfaattien, nitraattien ja hydroksidien) imeytyminen suolistosta on vähäistä sekä ihmisillä että eläimillä, ja se vaihtelee noin 0,5-2,0 %:n välillä ravinnon saannista riippuen. Joidenkin tietojen mukaan kromin imeytyminen on kääntäen verrannollinen sen saantiin ravinnosta (Anderson ja Kozlovsky, 1985). Tässä kokeessa ruokavalioon lisätyn kromioksidin määrä oli vain 0,01 %, ja edellä mainittujen kirjoittajien mukaan näin pienellä määrällä kromi johtaisi lisääntyneeseen imeytymiseen ruoansulatuskanavassa ja olisi siten helpommin havaittavissa koekalojen näytteistä.
Seitsemän vuorokauden ajan kontrolliruokavaliolla ruokittujen kalojen, eli kontrollieläinten, verrokkiravintoa saaneiden kalojen verinäytteiden oikaistut regressiot verrattaessa kontrolliruokavaliolla ruokittujen kalojen näytteillä oikaistuihin regressioihin eivät eronneet toisistaan mitenkään keskenään (P>0,05). Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä Utleyn ja muiden (1970) kanssa, jotka käyttivät myös radioaktiivista kromioksidia (III) suun kautta, mutta annettuna nautaeläimille, eivätkä havainneet säteilyä hiehojen veressä. Muissa tutkimuksissa raportoitiin 51CrCl3:n nopeasta kulkeutumisnopeudesta ruoansulatuskanavan läpi (Oberleas ja Stoecker, 1987) ja 51Cr:n nopeista huippupitoisuuksista rottien veressä (Hopkins Junior, 1965), ja veren pitoisuudet heijastavat kromi(III)-saantia. Jos siis kromioksidit kärsivät imeytymisestä ruoansulatuskanavassa, niiden esiintyminen olisi tässä tutkimuksessa havaittava nopeasti kalojen veressä.
Veressä imeytynyt kromi (III) sitoutuu enimmäkseen transferriiniin ja muihin proteiineihin, jotka vastaavat sen kulkeutumisesta elimistössä. Pitkäaikaista varastoitumista tapahtuu erityisesti maksaan, pernaan, luihin ja muihin elimiin (Lim et al., 1983). Kromin kertymismallit ovat seuraavassa järjestyksessä: munuaiset > maksa > kidukset H” lihakset, pienempien pitoisuuksien osalta (Palaniappan ja Karthikeyan, 2009).
Jos Niilin tilapia imeytti kromia inertin merkkiaineen muodossa, tämä mineraali kertyy kalan kudoksiin. Siksi sen määrittämiseksi, oliko kromin imeytymistä merkkiaineena, Niilin tilapian ruoansulatuskanavan kautta, verinäytteitä verrattiin vertailukaloista saatuihin korjattuihin regressioihin, regressioilla korjattuihin näytteisiin viskeraalisesta rasvasta, maksakudoksesta, lihaskudoksesta ja munuaiskudoksesta kaloista, jotka saivat koeruokavaliota ja jotka eivät eronneet toisistaan (P>0,05), ja niinpä niitä luonnehditaan yhteen lineaariseen regressiohin kuuluviksi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että koekalojen näytteissä ei havaittu radioaktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että merkkiainetta ei ole imeytynyt merkittävästi.
Kromin imeytymisestä suolistossa vastaavaa mekanismia ei tunneta hyvin. On epäselvää, imeytyykö Cr passiivisesti vai suolen limakalvolla sijaitsevien kantajaproteiinien avulla. Mertz et al. (1965) vastasivat, että kolmiarvoisen Cr:n imeytyminen ei näytä olevan tyydyttävä prosessi, mikä viittaa siihen, että se imeytyy passiivisen diffuusion avulla. Mertz ja Roginski (1971) raportoivat päinvastaista näyttöä. He havaitsivat, että kolmiarvoisen kromin imeytymisprosentti evertoiduista suolistopusseista väheni, kun Cr-pitoisuus inkubointiympäristössä kasvoi. Tämä havaittu kyllästymisvaikutus viittaa siihen, että kantajaproteiinit osallistuvat Cr:n imeytymiseen. Dowlingin ym. (1989) kokeessa pääteltiin kuitenkin, että epäorgaaninen, kolmiarvoinen kromi imeytyy passiivisen diffuusion välittymättömän prosessin avulla Cr:tä riittävällä ruokavaliolla ruokittujen rottien ohutsuolessa.
Febelin ym. (2001) saamien tulosten mukaan kromioksidia imeytyi 2,5 % tunnin aikana, ja imeytynyt kromi siirtyi maksaan, jossa maksakudokseen jäi 10,9 % kromioksidia. Nämä tulokset eroavat tämän tutkimuksen tuloksista, uskomme sen johtuvan siitä, että kromi 51Cr:n määrä ei kasvanut merkittävästi analysoiduissa kalojen kudoksissa: veressä, viskeraalisessa rasvassa, maksassa, munuaisissa ja kalojen tiedostossa, mikä ei ole viitannut merkkiaineen imeytymiseen ja sitä seuraavaan biokertymiseen. Kokeiden välillä oli eroa siinä, mitä järjestelmää käytettiin kalojen oikeiden olosuhteiden ylläpitämiseksi akvaariossa, ruokaan lisätyn merkkiaineen pitoisuudessa ja kalalajeissa.
Yksi mahdollinen selitys on se, että kromioksidi ei ole inertti merkkiaine ja että kromia imeytyy merkittävästi kromioksidina tai muina kromijohdannaisina, joita syntyy ruuansulatuksen yhteydessä, suolen seinämän läpi (Fernandez ym., 1999). Toinen selitys, jota Ng ja Wilson (1997) ehdottivat Shiaun ja Liangin (1995) tulosten selittämiseksi, on akvaariovedessä olevan kromin mahdollinen kulkeutuminen kalojen kidusten kautta, mikä johtuu siitä, että kalat tyhjentävät kromia sisältäviä ulosteitaan akvaarioveteen. Vaikka akvaarioveden vaihtuvuus olisi tehokasta, kromin pitoisuus kasvaa, mikä johtaa mineraalien imeytymiseen (Fernandez ym., 1999).
Tässä kokeessa staattisessa järjestelmässä jokapäiväiset akvaariot siivilöitiin jäämien vähentämiseksi ja rehun ja ulosteiden kerääntymisen välttämiseksi veteen, ja vain haihtumisen ja hoidon kautta menetetty vesi palautettiin. Tämä menettely aiheutti kromin pitoisuuden ja johtumisen mineraalin lineaariseen kasvuun akvaariovedessä ja kidusten näytteissä. Kertymä vaihtelee altistusajan ja ympäristön pitoisuuksien mukaan. Pienillä pitoisuuksilla kertyminen oli altistusajan mukaista (Palaniappan ja Karthikeyan, 2009).
Vesiympäristöissä esiintyvät raskasmetallit (esim. koboltti, kupari, mangaani, molybdeeni, sinkki ja kromi) ovat kriittinen huolenaihe, koska ne kertyvät vesieliöihin (Dimari et al., 2008). Kalat, jotka ovat useimpien vesielinympäristöjen pääkomponentteja, on myös tunnustettu hyviksi epäorgaanisten mineraalien biokertojiksi (King ja Jonathan, 2003). Myös kidusten on raportoitu olevan tärkeä paikka raskasmetallien kulkeutumiselle, mikä aiheuttaa kidusten vaurioita ja vaurioita (Bols et al., 2001). Tämän hypoteesin testaamiseksi tässä kokeessa 51Cr2O3:n ravintopitoisuus koekalojen ruokavaliossa oli 100 µg.g-1 , ja sen ominaisaktiivisuus oli 58,2 µCi. Näin ollen, jos alkuaine olisi imeytynyt kalojen ruoansulatuskanavaan, mahdollisesti akvaariovedessä olevien kidusten kautta tai mitä tahansa muuta reittiä, ainakin 51Cr:n vähenemisestä peräisin olevaa gama-säteilyä olisi pitänyt havaita Niilin tilapioissa.
Kun regressiot asetettiin, vertailukaloista otetut verinäytteet asetettiin vastakkain niiden verinäytteiden kanssa, jotka edustavat koeruokavaliota saaneiden kalojen suoliston ilman sisältöä, mahalaukun ilman sisältöä, ruoansulatuskanavan sisällön kerätyistä näytteistä saatuja tuloksia, oli lineaarinen nousu, ja vakiintuneiden regressioiden välillä havaittiin merkitseviä eroavaisuuksia (P<0,05). Nämä saadut tulokset viittaavat siihen, että suolisto ilman sisältöä, mahalaukun sisältö ilman sisältöä ja ruoansulatuskanavan sisältö kyllästivät kaloja seitsemän päivän koejakson aikana.
Clawsonin ym. (1955) saamat tulokset osoittavat, että ulosteen kromioksidipitoisuus tulee tasapainoon nautitun rehun pitoisuuden kanssa kolmen ja neljän vuorokauden välisenä aikana tämän yhdisteen ensimmäisestä ruokinnasta. Tässä tutkimuksessa kuitenkin seitsemänteen päivään asti merkkiaineen pitoisuus ulosteessa oli kohonnut, tämä ero voi johtua tässä kokeessa käytetyn merkkiaineen alhaisesta pitoisuudesta ja ruoansulatuskanavan välttämättömästä kyllästymisestä.
Tässä tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella olemme samaa mieltä Fernandezin ym. kanssa. (1999) kanssa siitä, että toinen mahdollinen selitys Shiaun ja Liangin (1995) sekä Shiaun ja Shyn (1998) saamille tuloksille olisi se, että kalojen kromipitoisuus noudattaa samaa kaavaa, jonka he havaitsivat muiden epäorgaanisten ravintoaineiden (kalsium, fosfaatti, tuhka) kohdalla, ja että sen pitoisuus lisääntyy kaloissa, joita ruokittiin kromioksidilla täydennetyillä ruokavalioilla, ja sen pitoisuus on suurimmillaan kromioksidipitoisuudella, joka on noin 5 – 10 grammaa/kg-1. Tämä nousu saattaa liittyä pikemminkin ruokavalion sisältämän luonnollisen kromin suurempaan pidätyskykyyn kuin täydennetyn kromioksidin imeytymiseen. On raportoitu (Evtushenko ym., 1986), että kudoksiin kertyneiden metallien taso pysyi poikkeuksetta tasaisella tasolla, vaikka organismit altistuivat niille jatkuvasti riittävän pitkän ajan.
Lisäksi näissä tutkimuksissa käytetyt merkkiainetasot (5-10 % kromioksidia ravintoon sisällytettynä), vaikka ne olisivatkin erittäin puhtaita, voivat tarjota muita kromikompleksin muodostumisen muotoja, jotka kalat voivat imeytyä ruoansulatuskanavasta tai muitakin reittejä pitkin.