Sanes ja Lichtman käyttivät pronukleaarista injektiota lisätäkseen nämä Brainbow-konstruktiot hiiriin. Kun he kuvasivat hiirten aivoja, he löysivät paljon enemmän kuin 3-4 väriä, mikä johtui useiden konstruktiokopioiden tandem-integraatiosta (noin 8 Brainbow-1.0-hiirissä.) Useiden, toisistaan riippumattomien rekombinaatiotapahtumien kombinatorinen vaikutus johtaa värien sateenkaariin. Kun konstruktiota on kolme kopiota, odotettavissa olisi kymmenen väriä (ks. taulukko oikealla); Sanes ja Lichtman ovat eri raporteissaan havainneet 90-160 erilaista väriä, jotka johtuvat suuremmasta kopiomäärästä. Nimi Brainbow on todella osuva tälle värikkäälle teknologialle.
Systeemin optimointi: Brainbow-3
Vaikka Brainbow tarjosi neurotieteilijöille laajan värivalikoiman, jota tarvitaan yksittäisten neuronien merkitsemiseen, järjestelmä kärsi myös useista rajoituksista. Ensinnäkin Brainbow-hiiren kudoksen kuvantaminen oli haastavaa alhaisen fluoresenssin intensiteetin vuoksi, joka johtui osittain fluorofoorin fotoinstabiilisuudesta, sekä fluorofoorien taipumuksesta aggregoitua neuronien somassa. Toiseksi järjestelmä ei mahdollistanut analyysia immunovärjäyksellä. Vaikka käytetyt fluorofoorit ovat fluoresoivasti erilaisia, niiden proteiinisekvenssit ovat hyvin homologisia, mikä estää kullekin fluorofoorille spesifisten vasta-aineiden suunnittelun. Kolmanneksi Brainbow-1 ja Brainbow-2 sisälsivät kumpikin ”oletustilan”; esimerkiksi Brainbow-1.0 ilmentää RFP:tä, kun konstruktioon ei ole tehty rekombinaatiota. Tätä oletustilaa ilmaisi suhteettomasti suurin osa neuroneista, mikä rajoitti tietyllä alueella havaittavien erilaisten värien määrää.
Vuonna 2013 Dawen Cai ym. julkaisivat Brainbow-teknologian hienosäädön, Brainbow-3.0:n, jonka tavoitteena oli poistaa edellä mainitut rajoitukset. Ensin he seuloivat erilaisia fluoresoivia proteiineja löytääkseen ne, joilla oli ihanteelliset ominaisuudet (vähäinen aggregaatio, korkea fotostabiilisuus ja korkea stabiilisuus fiksaation jälkeen.) Seitsemästä tuloksena saadusta proteiinista he valitsivat kolme, joilla oli vähän sekä fluoresenssia että sekvenssien päällekkäisyyksiä (koralli mOrange2, meduusa EGFP ja meriantilooppi mKate2.) Sen jälkeen he tuottivat onnistuneesti räätälöityjä vasta-aineita kullekin näille proteiineille, ja he vahvistivat, että ristiintyvyyttä ei ollut, mikä avasi oven immunovärjäysanalyyseille. Tasaisen solumerkinnän saavuttamiseksi he tuottivat fluoresoivista proteiineista farnesyloituja johdannaisia, jotka kulkeutuvat suoraan solukalvoille. Farnesyloitujen johdannaisten kalvokuljetus mahdollistaa herkkien aksoni- ja dendriittisten prosessien merkitsemisen, joita ei aiemmin ole voitu nähdä Brainbow-1:llä ja -2:lla.
Brainbow-1.0:n yleinen rakenne on säilynyt Brainbow-3.0:ssa, mutta fluoresooreina käytetään mOrange2:ta, EGFP:tä ja mKate2:ta; oletustila on mOrange2. Sitä vastoin Brainbow-3.1 ja -3.2 eivät näytä oletusarvoista fluoresenssia, koska niihin on lisätty translaatiota estävä STOP-kasetti heti promoottorin jälkeen. STOP-kasetti sisältää mutanttisen YFP:n, joka ei fluoresoi, mutta voidaan havaita immunovärjäyksellä. Tämä ominaisuus helpottaa Cre-negatiivisten Brainbow-hiirten seulontaa niiden solujen määrän ja tyypin määrittämiseksi, joissa konstruktio ilmentyy. Brainbow-3.2:n valonkestävyyttä on parannettu lisäämällä siihen metsäkauriin hepatiittiviruksen post-transkriptionaalinen säätelyelementti (WPRE), jota käytetään yleisesti transgeenin proteiinipitoisuuksien kasvattamiseen.
Brainbow-variantit ja sovellukset hiiren aivojen ulkopuolella
Sanes ja Lichtman kehittivät Brainbow-järjestelmän parantamisen lisäksi myös täydentävän Flpbow-konstruktion, joka on toiminnallisesti samanlainen kuin Cre-pohjainen Brainbow, mutta jota ohjaa FLP/FRT-rekombinaasi. Kun ne asetetaan eri promoottoreiden alle, Brainbow- ja Flpbow-rakenteita voidaan käyttää eri solupopulaatioiden merkitsemiseen.
Voidakseen vähentää Brainbow-siirtogeenejä ja Cre:tä sisältävien eläinten tuottamiseen tarvittavaa eläinjalostusta Cai ym. loivat myös Autobow-konstruktion, joka sisältää sekä Cre:n että XFP:n. Cre-tuotanto ohjaa rekombinaatiota ja XFP-valintaa, jota seuraa Cre:n itsekarsinta. Nämä konstruktiot säilyvät vakaasti vähintään kuuden sukupolven ajan.
Neuronaalisten pThy1-Brainbow-konstruktioiden lisäksi Addgenellä on saatavilla myös kaksi Brainbow-adeno-assosioitunutta virusvektoria (AAV) – AAV-EF1a-BbChT ja AAV-EF1a-BbTagBY. Nämä konstruktiot sisältävät kumpikin kaksi XFP:tä AAV:hen liittyvien kokorajoitusten vuoksi; molempien konstruktioiden yhteisinfektio tuottaa vähintään 8 väriä. AAV:n käyttö mahdollistaa alueellisen ja ajallisen kontrollin ilman sukusolujen muokkausta, ja Brainbow’ta voidaan käyttää useilla lajeilla.
Muut laboratoriot ovat luoneet lisää variantteja, mukaan lukien Hugo J. Snippertin ym. (2010) kuvaama R26R-Confetti ja Karine Loulierin ym. (2014) kuvaama MAGIC-merkkistrategia.
Nykyaikana Brainbow-tekniikoita sovelletaan myös malliorganismien, kuten Drosophilan ja seeprakalan, tutkimiseen. Drosofilassa Brainbow on auttanut hermopiirien, kuten motoneuronien ja hermo-lihasliitoksen välisten yhteyksien kartoittamisessa. Seeprakaloissa menetelmästä on tullut erittäin käyttökelpoinen sukulinjojen jäljittämisessä; ”Zebrabow’ta” käytettiin sarveiskalvon epiteelin kehityksen jäljittämiseen.
Neurotieteestä ja kehityksestä kiinnostuneille tutkijoille Brainbow on arvokas väline yksittäisten solujen merkitsemiseen ja seuraamiseen laajan värivalikoiman ja värin suuren pysyvyyden ansiosta. Sanes ja Lichtman arvioivat, että Brainbow’n värillinen merkintä on lyhentänyt tietyn aivo-osion kartoitusaikaa vähintään kertaluokkaa. On selvää, että Brainbow-tekniikan jatkokehittelyn avulla saadaan tärkeää tietoa aivojen ja muiden biologisten järjestelmien monimutkaisesta fysikaalisesta organisaatiosta.
Kiinnostuitko soveltamaan Brainbowta tutkimukseesi? Tutustu Addgenestä saataviin Brainbow-plasmideihin!
Find Brainbow Plasmids @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmidit
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plasmidit
Transgeeniset strategiat fluoresoivien valkuaisproteiinien yhdistelmälliselle ilmentämiselle hermostossa. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
A technicolour approach to the connectome. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Suolen kryptojen homeostaasi johtuu symmetrisesti jakautuvien Lgr5-kantasolujen välisestä neutraalista kilpailusta. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: rekombinaasipohjainen fluoresenssimerkintätekniikka neuraalisten ilmentymismallien jakamiseen. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: geneettinen monivärinen solumerkintä hermopiirien analysointiin Drosophila melanogasterissa. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Improved tools for the Brainbow toolbox. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: monispektrinen solumerkintä solujen jäljittämiseen ja sukulinjojen analysointiin seeprakalassa. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
.