Tutkimuksessamme, havaitsimme takautuvasti CALR-mutaatioiden esiintymisen 524 JAK2 V617F-negatiivisen potilaan kohortissa, joka esitti kliinisen ja/tai laboratorioepäilyn MPN:stä, päätavoitteena määrittää tämän havaitsemisen diagnostinen arvo. Tarkastelujakson aikana CALR-mutaatioita ei ollut rutiininomaisesti tutkittu keskuksessamme potilailta, joilla epäiltiin MPN:ää, koska ne on löydetty vasta äskettäin1,2. Sitä vastoin JAK2 V617F -mutaatio on analysoitu rutiininomaisesti jo siitä lähtien, kun se löydettiin vuonna 200520. Siksi JAK2 V617F -positiiviset potilaat jätettiin tutkimuksen ulkopuolelle. MPL-mutaatio on suhteellisen harvinainen löydös MPN-potilailla, ja sitä esiintyy useimmiten potilailla, joilla on joko ET tai PMF21. Laboratoriossamme MPL-testi sisällytettiin vasta hiljattain diagnostiseen algoritmiin potilailla, joilla epäillään MPN:ää, ja se tehdään vasta sen jälkeen, kun JAK2 V617F- ja CALR-mutaatiot on suljettu pois. Siksi MPL-statusta ei määritetty kaikille potilaillemme ensimmäisen tutkimuksen yhteydessä.
Keskuksemme on yliopistollinen sairaala, joka palvelee noin 1 000 000 asukkaan alueella ja on hematologisten maligniteettien lähetekeskus. Kaikki hematologiselle osastolle lähetetyt potilaat arvioivat ensin yleislääkärit, joilla ei ollut yksityiskohtaista tietoa hematologisista pahanlaatuisista kasvaimista. Kuten taulukossa 3 esitetään, vain osalla hematologian osastolle lähetetyistä potilaista oli patologiset kliiniset ja/tai laboratorioparametrit, jotka epäilyttivät MPN:ää ensimmäisen tutkimuksen yhteydessä. Näin ollen suurin osa hematologian osastolle lähetetyistä potilaista oli henkilöitä, joilla ei ollut hematologista pahanlaatuista kasvainta, sillä 380 potilaalla (380/524 = 72,5 %) ei ollut MPN:ää. Näillä potilailla diagnosoitiin perifeerisen veren pitoisuuden sekundaarisia muutoksia, jotka johtuivat erilaisista olosuhteista, kuten raudanpuutteesta, infektio- ja tulehdussairauksista, hyposplenismistä, pahanlaatuisista sairauksista, tupakoinnista, äskettäisestä leikkauksesta, kortikosteroidien käytöstä ja kroonisesta hypoksiasta. Näin ollen CALR-positiivisten potilaiden määrä kohortissamme oli pieni. Tunnistimme 4,4 prosenttia MPN-epäilypotilaista CALR-positiivisiksi, joista suurimmalla osalla diagnosoitiin joko ET tai PMF. Useimmissa samankaltaisissa tutkimuksissa analysoitiin niiden CALR-positiivisten potilaiden määrää, joilla oli todettu MPN, joten CALR-positiivisten potilaiden määrä oli paljon suurempi, vaihteli 12:sta yli 20 prosenttiin22,23,24,25,26. Tietojemme perusteella olisi hyödyllistä parantaa diagnostista lähestymistapaa potilaisiin, joilla on kohonnut yhden tai useamman verisolulinjan pitoisuus, sillä useimmissa tapauksissa tämä ei johdu hematologisesta pahanlaatuisuudesta. Potilaat olisi rutiininomaisesti seulottava sekundaarisen erytrosytoosin, trombosytoosin ja leukosytoosin yleisimpien syiden varalta, ja verenkuva olisi toistettava vähintään kerran seurantakäyntien yhteydessä ennen hematologian osastolle lähettämistä. Molekyyligeneettinen testaus olisi varattava potilaille, joilla on suuri epäily klonaalisesta hematologisesta taudista, eikä sitä pitäisi tehdä kaikille hematologian osastolle ohjatuille potilaille.
CALR-mutaatioita tunnistetaan yleisesti JAK2 V617F-negatiivisilla potilailla, joilla on ET1,2. Meidän keskuksessamme vain vähemmistöllä CALR-positiivisista potilaista (7/23 = 30 %) diagnosoitiin ET vuoden 2008 WHO-kriteerien mukaisesti ensimmäisen tutkimuksen yhteydessä. Tärkein syy tähän oli se, että luuydintutkimuksiin suhtauduttiin varauksellisesti potilailla, joilla oli kohtalainen trombosytoosi ja pieni tromboottisten komplikaatioiden riski. Tämä tarkoittaa kuitenkin sitä, että olemme saattaneet aliarvioida niiden potilaiden määrän, joilla on klonaalinen trombosytoosi. Vahvistamalla CALR-mutaatioiden esiintyminen pystyimme takautuvasti diagnosoimaan yhdeksällä potilaalla ET:n WHO:n muutettujen ET-kriteerien13 mukaisesti. Vaikka kaikkia näitä potilaita seurattiin osastollamme klonaalisen trombosytoosin suuren epäilyn vuoksi, ET:n diagnoosin varmistamisesta ei-invasiivisella menetelmällä, kuten molekyyligeneettisellä testauksella, on suurta hyötyä ennusteen ja hoidon kannalta. CALR-mutaatiot ovat näin ollen ET:n tärkeitä diagnostisia tunnusmerkkejä, kuten myös kirjallisuudessa on hiljattain vahvistettu27,28.
Kaikki PMF-potilaat diagnosoitiin WHO:n kriteerien mukaisesti hematologian osastolla tehdyssä tutkimuksessa. CALR-mutaation tunnistaminen vahvisti diagnoosin takautuvasti, mutta sillä ei ollut suoraa diagnostista tai terapeuttista vaikutusta.
CMML on MDS:ien/MPN:ien alatyyppi eikä varsinaisesti MPN12. CMML-potilailla esiintyvät CALR-mutaatiot ovat erittäin harvinaisia, eikä niillä ole merkittävää roolia CMML:n patogeneesissä. Zamoran ym. ryhmätutkimus osoitti, että vain yhdellä potilaalla 174:stä CMML-potilaasta oli CALR-mutaatio29. Tutkimuksemme potilas, jolla diagnosoitiin ykköstyypin CMML ja joka myöhemmin eteni myelofibroosiin, saatettiin diagnosoida väärin ensimmäisen tutkimuksen yhteydessä, sillä PMF:llä ja CMML:llä on monia yhteisiä piirteitä, kuten monosytoosi ja luuytimen fibroosi. Hu ym. hiljattain tekemässä tutkimuksessa monet CMML-diagnoosin saaneet potilaat voitiin tarkemman analyysin avulla luokitella uudelleen PMF:ksi, mikä osoittaa, että tarkan diagnoosin tekemiseksi olisi tehtävä perusteellisempi analyysi, erityisesti potilailla, joilla on ET/PMF:lle tyypillisiä molekulaarisia biomarkkereita11,30.
Lisäksi on kuvattu yli 50 frameshift-CALR-mutaatiota, jotka kaikki sijaitsevat CALR-geenin eksonissa yhdeksän. CALR-mutaatioita on kahta päätyyppiä: tyyppi 1 (52-bp:n deleetio; p.L367fs*46) ja tyyppi 2 (5-bp:n TTGTC-insertio; p.K385fs*47). Molekyyliominaisuuksiensa perusteella muut mutaatiot voidaan ryhmitellä tyypin 1 kaltaisiksi ja tyypin 2 kaltaisiksi31. Tutkimuksessamme yleisin CALR-mutaatiotyyppi oli tyyppi 1, mikä vastaa kirjallisuudesta saatuja tietoja2,16,32. Mutaatiot, jotka eivät ole tyypin 1 eivätkä tyypin 2 mutaatioita, olisi luokiteltava tyypin 1 kaltaisiksi tai tyypin 2 kaltaisiksi mutaatioiksi, koska tällä voi olla vaikutusta kliiniseen fenotyyppiin ja PMF:n tapauksessa jopa eloonjäämiseen17. Tutkimuksessamme tyypin 1 kaltaiset ja tyypin 2 kaltaiset mutaatiot määriteltiin käyttämällä AGADIR-algoritmia15 , joka on tilastollinen approksimaatioalgoritmi, joka laskee kierteisyysalttiuden 31 ainutlaatuiselle aminohapposekvenssille, joita CALR-mutaatiot muuttavat16. Tätä algoritmia on käytetty vastaavissa tutkimuksissa, ja se on tärkeä väline CALR-mutaatioiden alaluokittelussa16,17. Vaikuttaa erittäin tärkeältä määritellä CALR-mutaation tyyppi oikein, koska sillä on myös diagnostisia vaikutuksia. Tiedetään, että ainoastaan mutaatiot, jotka johtavat lukukehyksen + 1 (-1 + 2) kehyssiirtymään, ovat patogeenisiä6. Muut CALR-mutaatiot voivat olla CALR:n sukusoluvariantteja, joiden kliinistä merkitystä ei tunneta. Tutkimuksessamme kahdella potilaalla havaittiin muita kuin frameshift CALR-mutaatioita. Toisella näistä potilaista diagnosoitiin reaktiivinen trombosytoosi hematologian osastolla tehdyssä tutkimuksessa, ja hänet määritettiin takautuvasti CALR-positiiviseksi. Yksityiskohtainen analyysi vahvisti missense CALR-mutaation, joka johtaa glutamiinihapon korvautumiseen asparagiinihapolla aminohappoasemassa 398. Sama mutaatio löydettiin potilaalta, jolla oli WHO:n määrittelemä krooninen neutrofiilinen leukemia (CNL), Lashon ym. tutkimuksessa. Hänen tutkimuksessaan todettiin, että CALR-mutaatiot, jotka eivät johda erillisen C-terminaalin muodostumiseen, viittaavat erilaiseen patogeneettiseen mekanismiin, joka saattaa olla vielä tuntematon33. Tutkimuksessamme oletimme, että potilaallemme ei kehittynyt CALR-mutaatiota, joka merkitsisi klonaalista hematologista sairautta. Potilaan anamneesin, kliinisen tutkimuksen ja laboratoriolöydösten perusteella se viittasi lähinnä reaktiiviseen trombosytoosiin. Tämän artikkelin kirjoittamishetkellä potilas oli hyvässä kunnossa ilman mahdollisia klonaaliseen hematologiseen tautiin liittyviä komplikaatioita.
Toisella potilaalla, jolla oli ei-frameshift CALR-mutaatio, diagnosoitiin MPN-U. Tämä potilas kantoi CALR-geenin itulinjan in-frame-deletiota (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), joka oli jo tunnistettu oireilevalla potilaalla, jolla oli MPN34. Vaikka KDEL-motiivi säilyi, yhden aminohapon poisto (p.(Glu381del)) johti proteiinin sekundäärirakenteen ja kolmiulotteisen rakenteen muuttumiseen, mikä johti johtopäätökseen tämän in-frame-deleetion patogeenisestä luonteesta23,34,35. Potilaamme, jolla oli MPN-U, oli valitettavasti menetetty seurantaan, eikä tarkkaa hematologista diagnoosia tai mahdollisia komplikaatioita voitu määritellä. Laboratoriolöydökset viittasivat kuitenkin klonaaliseen hematologiseen sairauteen.
Tutkimuksessamme löysimme eksonista 9 neljä uutta CALR-mutaatiota, joita ei tietojemme mukaan ole vielä rekisteröity COSMIC- (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) tai HGMD-tietokantaan (http://www.hgmd.cf.ac.uk). COSMIC-tietokanta on maailman suurin asiantuntijoiden kuratoima tietokanta ihmisen syövän somaattisista mutaatioista. Siinä kuvataan yli 4 miljoonaa koodaavaa mutaatiota36. HGMD-tietokantaan on yritetty koota kaikki tunnetut (julkaistut) geenimuutokset, jotka ovat vastuussa ihmisen perinnöllisistä sairauksista19. Tutkimuksessamme määritellyt uudet mutaatiot ovat NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1132_1154delAinsGTTGTC, p.(Glu378Argfs*45). Kaikki nämä mutaatiot olivat tyypin 2 kaltaisia mutaatioita.
ET ja PMF liittyvät lisääntyneeseen tromboottisten ja tromboembolisten tapahtumien riskiin, jotka ovat merkittäviä sairastuvuuden ja kuolleisuuden syitä37. Tromboottisten ja tromboembolisten komplikaatioiden riskin pienentäminen on yksi hoidon tärkeimmistä tavoitteista erityisesti ET-potilailla38. Näillä potilailla on myös suurempi riski verenvuotokomplikaatioihin, jotka voivat liittyä hoidon komplikaatioihin tai hankittuun von Willebrandin oireyhtymään (AVWS, acquired von Willebrand syndrome), joka johtuu äärimmäisestä trombosytoosista (verihiutaleet > 1000 × 109/L)28,39,40. Tromboosin riski ET-potilailla on yli 20 %41. Ruotsalaisessa tutkimuksessa 35 prosentille ET-potilaista kehittyi verisuonikomplikaatioita42. PMF:ssä tromboottiset tapahtumat ovat suunnilleen yhtä yleisiä kuin ET:ssä43. PMF-potilaiden tromboottisten komplikaatioiden esiintyvyys on 7-30 prosenttia44,45,46. Tutkimuksessamme tromboottisten komplikaatioiden esiintyvyys CALR-positiivisilla potilailla oli 30 %. Kolmelle potilaalle oli kuitenkin kehittynyt tromboottinen komplikaatio yli 10 vuotta ennen MPN-diagnoosin epäilyä. Tromboottisten komplikaatioiden todellinen esiintyvyys tutkimuksessamme oli siis pienempi. Yhdelle potilaalle kehittyi lasiaisverenvuoto, joka oli seurausta riittämättömästä antikoagulaatiohoidosta varfariinilla. Kummallakaan niistä kahdesta potilaasta, joilla oli verenvuotokomplikaatio, ei ollut äärimmäistä trombosytoosia komplikaatiohetkellä. JAK2 V617F- ja MPL-mutaatioihin verrattuna CALR on suotuisa mutaatio, ja siihen liittyy vähemmän tromboottisia tapahtumia1,2,47. Useimmilla CALR-positiivisilla potilailla, joille kehittyi trombo-hämorragisia komplikaatioita, todettiin tyypin 1 mutaatioita (71,4 %). Kuten on jo osoitettu, potilailla, joilla oli tyypin 1 kaltaisia mutaatioita, oli suurempi tromboosiriski kuin potilailla, joilla oli tyypin 2 kaltaisia mutaatioita10.
CALR-mutaatioiden tiedetään tällä hetkellä olevan yksi kolmesta tärkeimmästä mutaatiotyypistä JAK2 V617F:n ja MPL-mutaation lisäksi ET- tai PMF-potilailla. ET- tai PMF-potilaista 10-15 %:lla oli kuitenkin edelleen sellaisia potilaita, joiden taudin taustalla oleva molekyyligeneettinen markkeri oli tuntematon. Näitä potilaita kutsutaan ”kolmoisnegatiivisiksi ”48 . Näiltä potilailta on etsitty uusia molekulaarisia biomarkkereita sekvensoimalla myelooisten syöpägeenien koodaavia eksoneita, mikä on tuottanut lupaavia tuloksia. Tämä voi tarjota yksilöllisen lähestymistavan MPN-potilaiden diagnosointiin49.
CALR-mutaatioita MPN-potilailla tutkitaan myös niiden terapeuttisen potentiaalin selvittämiseksi50,51,52. CALR:n eksoni 9 -mutaatiot voisivat olla syövän immuunihoidon kohteita, koska niiden on osoitettu toimivan immunogeenisina uusantigeeneina51. MPN:n hoidossa voisi olla hyödyllistä yhdistää CALR-rokotteet immunomoduloiviin hoitomuotoihin53 , kuten interferoni-alfa (IFN-α)54 tai ohjelmoidun kuoleman 1 ligandi (PD-L1)55 , yhdistelmäsyöpärokotuksena53. Sen lisäksi, että CALR-mutaatiot ovat tärkeitä diagnostisia ja ennusteellisia merkkiaineita MPN-potilailla, niistä voi tulevaisuudessa tulla tärkeä hoitokohde MPN-potilaiden alaryhmässä.