CD11c+ monosyytit/makrofagit edistävät kroonista Helicobacter hepaticus -indusoitua suolistotulehdusta IL-23:n tuotannon kautta

H. hepaticuksen aiheuttama tulehdus muuttaa suolen mononukleaaristen fagosyyttien osastoa

Gramnegatiivinen bakteeri Helicobacter hepaticus (Hh) on ei-invasiivinen organismi, jota tavataan yleisesti hiirten alemman suolikanavan limakalvokerroksessa. Bakteerin infektoimille villityyppisille eläimille ei kehity suoliston immunopatologiaa, ja ne toimivat infektion kantajina.21 Hiiret, joilla on geneettisiä puutteita IL-10/IL-10R-reitissä, ovat kuitenkin alttiita kokeelliselle Hh-infektiolle, ja niille kehittyy vakava paksusuolen ja paksusuolen tulehdus (typhlocolitis), johon liittyy epiteelin hyperplasiaa.22 , 23 Vastaavasti villityypin hiirten Hh-infektio ja samanaikainen anti-IL-10R-monoklonaalisten vasta-aineiden (mAbs) antaminen laukaisee IL-23-riippuvaisen suolistotulehduksen sekä voimakkaan T-auttajatyypin 1/tyypin 17 (Th1/Th17) polarisoituneen efektori-T-soluvasteen.23 Hh-infektoituneille ja anti-IL-10R-vasta-aineilla hoidetuille hiirille, mutta ei infektoimattomille tai vain yhdellä hoidolla hoidetuille kontrollihiirille kehittyy koliitin histologisia piirteitä 2-3 viikon kuluessa infektiosta (kuva 1a). Hh:lla ja anti-IL-10R-vasta-aineilla käsitellyillä hiirillä esiintyy lisäksi merkittävää leukosyyttien infiltraatiota lamina propriaan (kuva 1b), mukaan lukien neutrofiilien ja MHCII+-monosyyttien vallitsevat populaatiot (kuva 1c ja täydentävä kuva S1a verkossa). Palamattomassa paksusuolessa verestä lamina propriaan pääsevät monosyytit synnyttävät ensisijaisesti kudosmakrofageja11 (määritelty CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo-soluiksi, vihreä alaryhmä), jotka ilmentävät suuria määriä CD64-, MHCII-, F4/80- ja CD11c-soluja (kuva 1d ja täydentävä kuva S1b). Tämä prosessi kuitenkin muuttuu dramaattisesti tulehduksen aikana, ja havaitsimme MHCII+ monosyyttien (määritelty CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi-soluiksi, punainen alaryhmä) merkittävän kertymisen paksusuolen lamina propriaan. Näille soluille on ominaista CD64:n ja MHCII:n ilmentyminen ja F4/80:n, CD24:n ja CD11c:n keskitasot (kuva 1c-e ja lisäkuva S1a). Vakaassa tilassa MHCII+-monosyytit ja makrofagit ilmentävät mannoosireseptoria (CD206), joka on merkkiaine, joka liittyy tulehdusta ehkäisevään makrofagitoimintaan.24 CD206:n ilmentyminen oli kuitenkin vähäisempää MHCII+-monosyyteissä ja makrofageissa paksusuolentulehduksen aikana (kuva 1f), mikä viittaa siihen, että monosyyttien lisäksi myös makrofaagien toiminnot muuttuivat tulehduksen aikana. Todellakin havaitsimme, että tulehduksen aikana MHCII+-monosyytit ekspressoivat suurempia määriä tuumorinekroositekijä-α- ja IL-6-proteiinia sekä Nos2:n (indusoituvan typpioksidisyntaasin) mRNA:ta, ja että IL-6:n määrä lisääntyi myös makrofageissa (lisäkuva S1c). Sekä MHCII+-monosyyttien että makrofagien IL-10-tuotanto lisääntyi myös tulehduksen aikana (Täydentävä kuva S1c), mikä todennäköisesti kuvastaa tulehduksen aiheuttamaa negatiivista takaisinkytkentärataa.

Makrofageiksi erilaistumisensa lisäksi MHCII+-monosyyttien on osoitettu erilaistuvan Ly6Clo CX3CR1int heterogeeniseksi osajoukoksi, joka on sukua sekä makrofageille että klassisille DC:ille.11 Tämän heterogeenisen osaston joukosta CD11b+ DC:t (määritelty CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int-soluiksi, harmaa osajoukko) voidaan helposti erottaa makrofageista homeostaattisissa olosuhteissa. CD11b+ DC-solut ilmentävät MHCII:tä, CD24:ää ja CD11c:tä, mutta niistä puuttuu makrofageihin yleisesti liitettyjen merkkiaineiden CD64 ja F4/80 ilmentyminen (kuva 1d ja lisäkuva S1b). Makrofagien ja CD11b+ DC-solujen välinen ero hämärtyi kuitenkin tulehduksen aikana CD64:ää ilmentävän populaation ilmaantuessa (kuva 1d,e), ja tällä hetkellä on epäselvää, miten nämä solut ontogeenisesti ja funktionaalisesti liittyvät vakaassa tilassa oleviin makrofageihin tai CD11b+ DC-soluihin.

Koliitin aikana MHCII+ monosyyttien huomattava kertyminen korreloi makrofagien, CD11b+ DC:iden ja CD103+ DC:iden (määritelty CD11c+ CD103+ CX3CR1- soluiksi, oranssi osajoukko) pienentyneen frekvenssin kanssa CD45+ lamina propria -solujen joukossa (kuva 1c,d). Absoluuttiset lukumäärät osoittivat kuitenkin CD11b+ DC-solujen ja CD103+ CD11b+ DC-solujen pientä lisääntymistä. Sitä vastoin makrofagien määrät pysyivät ennallaan ja CD103+ CD11b- DC:t vähenivät hieman (lisäkuva S1a).

Kokonaisuutena Hh-infektio IL-10R:n salpauksen läsnä ollessa laukaisee suolistotulehduksen, johon liittyy dramaattisia muutoksia myeloidisessa osastossa. Havaitsimme granulosyyttien ja MHCII+-monosyyttien vallitsevan kertymisen paksusuolen lamina propriaan. Lisäksi MHCII+-monosyytit ja makrofagit saivat proinflammatorisemman profiilin.

CD11c+-mononukleaariset fagosyytit ohjaavat koliitin kehittymistä IL-23:n tuotannon kautta

Koska IL-23:n on tunnistettu olevan koliitin pääasiallinen aiheuttaja tässä mallissa,23 tutkimme seuraavaksi mononukleaaristen fagosyyttien tuottaman IL-23:n funktionaalista merkitystä paksusuolitulehduksen kehittymisessä Hh+-vastainen-il-IL-10R-mallissa. Siksi risteytimme hiiret, jotka ilmentävät vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ja Cre-rekombinaasia CD11c-promoottorin (jota koodaa Itgax)25, 26 ohjaamana, hiirien kanssa, joilla on kaksi loxP-kohtaa, jotka reunustavat Il23a-geenin neljää eksonia27 , luodaksemme hiiret, joilla on kaksi loxP-kohtaa Il23a-geenin27 neljän eksonin vieressä, luodaksemme hiiret, joilla on Cd11c-Cre.Il23afl/fl-hiiret.

Koska CD11cIL-23-hiiret ilmentävät GFP:tä CD11c-promoottorin ohjaamana eikä niitä siksi voida risteyttää CX3CR1-GFP-reporttihiirien kanssa, turvauduimme vaihtoehtoiseen porttistrategiaan arvioidaksemme myelooista osastoa näissä hiirissä (täydentävä kuva S2). Tasapainotilassa CD11cIL-23-hiirillä oli paksusuolessa samanlainen määrä leukosyyttejä kuin niiden IL-23-pätevillä lajitovereilla (CD11cIL-23+) (Täydentävä kuva S3a), eikä myelooisten tai T-solujen frekvensseissä havaittu merkittäviä muutoksia (Täydentävä kuva S3b). Koska IL-23:a tarvitaan erilaistuneiden Th17-solujen ylläpitämiseen,28 CD11cIL-23-hiirillä oli kuitenkin voimakkaasti vähentynyt IL-17+ ja IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-solujen määrä paksusuolessa (Täydentävä kuva S3c).

Hh-infektion ja anti-IL-10R-hoidon jälkeen CD11cIL-23-hiirillä koliitti väheni silmiinpistävästi CD11cIL-23+-hiiriin verrattuna, ja epiteelin kryptojen hyperplasia väheni ja leukosyyttien infiltraatio oli vähäisempää koko paksusuolessa ja paksusuolessa (kuva 2a,b). CD11cIL-23-hiirillä ei myöskään ilmennyt pernomegaliaa (kuva 2c), mikä osoittaa, että ne olivat myös suojassa systeemisiltä taudin oireilta. CD11cIL-23-hiirillä havaittu vähäisempi patologia ei johtunut erilaisesta bakteerikuormituksesta, sillä Hh-kolonisaatiotasot olivat samanlaiset CD11cIL-23- ja CD11cIL-23+-ryhmissä (kuva 2d). Vähentyneiden patologisten muutosten mukaisesti sekä synnynnäiset että adaptiiviset efektorisytokiinit vähenivät voimakkaasti CD11cIL-23-hiirten paksusuolessa Hh:n ja IL-10R:n eston jälkeen (kuva 2e), samoin kuin itse IL-23:n määrä (kuva 2f).

Vähentyneen leukosyytti-infiltraationsa mukaisesti CD11cIL-23-hiirillä havaittiin Hh-infektion ja IL-10R:n salpauksen jälkeen sekä MHCII- että MHCII+-monosyyttien (kuvio 3a) ja neutrofiilien (lisäkuvio S3d) vähentynyt frekvenssi ja lukumäärän vähenemä lamina propria -alueella verrattuna vastaavalla tavalla käsiteltyihin CD11cIL-23+-alkuisiin koe-eläimiin. Monosyyttien vähäisempi infiltraatio CD11cIL-23-hiirissä korreloi lamina propria -makrofagien suuremman frekvenssin kanssa, kun taas CD11b+ DC:iden ja CD103+ DC:iden frekvenssit pysyivät muuttumattomina ja absoluuttiset lukumäärät olivat pienentyneet (Täydentävä kuva S3d).

Koska IL-23 ohjaa suolistotulehdusta vaikuttamalla suoraan T-soluihin ja edistämällä niiden kerääntymistä ja lisääntymistä paksusuolessa,29 tutkimme paksusuolen T-solukompartimenttia CD11cIL-23- ja CD11cIL-23+-hiirissä paksusuolen tulehduksen aikana. CD11cIL-23-hiirillä oli vähemmän paksusuolen CD4+ T-soluja kuin niiden IL-23-profektiivisillä lajitovereilla (kuva 3b). Kun CD11cIL-23+-hiiret saivat aikaan voimakkaan Th1/Th17-efektorivasteen, jolle oli ominaista yksi- ja kaksoistuotantoisten IL-17A+/IFNγ+ T-solujen ilmaantuminen, CD11cIL-23-hiiret osoittivat vain lievää vastaavien sytokiinien induktiota (kuva 3c).

Kokonaisuutena voidaan todeta, että koliitin puuttuminen CD11cIL-23-hiirillä viittaa siihen, että IL-23:n tuottamisella CD11c:tä ilmentävillä monisoluisilla proteiinihiukkasilla (MNP-hiiret, CD11c-expressing MNPs, IL-23:lla) on ei-yksityinen rooli suolen tulehdusreaktiossa.

MHCII+-monosyytit ja makrofagit ovat tärkein IL-23:n lähde H. hepaticus -infektion yhteydessä

Ymmärtääksemme paremmin koliitin kehittymiseen liittyvää tapahtumaketjua IL-23-puutteellisilla hiirillä seurasimme ensin IL-23:n ilmentymistä paksusuolen lamina propriaan puhdistetuissa leukosyyteissä. Il23a:n mRNA-ekspressio oli johdonmukaisesti havaittavissa 4-5 päivää koliitin alkamisen jälkeen (kuva 4a), mikä viittaa siihen, että kudosresidenssissä oleva ja/tai nopeasti mobilisoituva solujen osajoukko osallistuu IL-23:n varhaiseen tuotantoon paksusuolessa. Siksi valitsimme tämän ajankohdan myöhempiin analyyseihin. Neljän päivän kuluttua Hh-infektiosta ja anti-IL-10R-hoidosta CD11cIL-23+-hiirillä havaittiin lisääntynyt leukosyyttien infiltraatio lamina propriaan verrattuna infektoimattomiin kontrollihiiriin (kuva 4b). Tämä sisäänvirtaus korreloi kaikkien MNP-alaryhmien lisääntyneiden lukumäärien kanssa paksusuolessa (lisäkuva S4a,b) sekä lisääntyneiden MHCII- ja MHCII+-monosyyttien (kuva 4c,d), neutrofiilien (kuva 4d), CD103+ CD11b- DC:iden ja CD103+ CD11b+ DC:iden (kuva 4e) frekvenssien kanssa. Makrofagien ja CD11b+ DC:iden frekvenssit leukosyyttien kokonaismäärästä eivät kuitenkaan muuttuneet tässä vaiheessa (kuva 4d).

Kuvaillaksemme tarkemmin IL-23-riippuvaiseen suolistotulehdukseen osallistuvia myeloidisia alaryhmiä tutkimme CD11c-Cre-assosioituneen GFP:n ilmentymää CD11cIL-23+-hiirten lamina propria -soluissa. CD45+-solujen analyysi vahvisti, että Cre-GFP-ekspressio rajoittui leukosyytteihin, jotka ilmentävät CD11c:tä solupinnallaan (kuva 4f), mutta sitä havaittiin pääasiassa CD11chi-soluissa. Lisäksi Cre-assosioitunutta GFP-fluoresenssia havaittiin vain MHCII+-soluissa (kuva 4g), ja mielenkiintoisesti Il23a-mRNA:n ilmentyminen rajoittui Cre-GFP+-soluihin (kuva 4h). Suurin osa lamina propria MNP:stä ilmentää runsaasti CD11c:tä (kuva 1e ja lisäkuva S1b). Erillisten myeloidisten alaryhmien analyysi CD11cIL-23+-hiirissä osoitti, että CD11c-Cre-assosioitunut GFP-ekspressio havaittiin pääasiassa makrofageissa, CD103+ CD11b- DC:ssä, CD103+ CD11b+ DC:ssä, (kuva 4i) ja CD11b+ DC:ssä (ei esitetty). Lisäksi yli puolet MHCII+-monosyyteistä oli Cre-GFP-positiivisia, mikä osoittaa, että kaikki nämä alaryhmät saattavat olla potentiaalisia IL-23:n lähteitä. Sitä vastoin Cre-ekspressio puuttui eosinofiileistä, neutrofiileistä ja MHCII- monosyyteistä (kuva 4i).

Kuvaillaksemme, mitkä näistä alaryhmistä edustavat IL-23:n toiminnallista lähdettä in vivo, arvioimme Il23a:n mRNA:n ilmentymistä vastaavissa populaatioissa, jotka oli lajiteltu virtaussytometrialla CD11cIL-23- ja CD11cIL-23+-hiiristä 4 päivää Hh-infektion jälkeen IL-10R:n eston yhteydessä. On silmiinpistävää, että Il23a-mRNA:n ilmentyminen CD11cIL-23+-soluissa rajoittui enimmäkseen MHCII+-monosyytteihin ja makrofageihin, ja vähäistä ilmentymistä oli havaittavissa CD103+-CD11b- DC-soluissa ja CD103+-CD11b+ DC-soluissa (kuva 4j). Lisäksi sekä MHCII+-monosyyttien että makrofagien Il23a-ekspressio väheni selvästi CD11cIL-23-hiirissä, mikä osoittaa, että CD11c-Cre-ekspressio oli aktiivinen näissä solujen osajoukoissa (kuva 4j). MHCII- monosyyteissä havaittu vähäinen Il23a:n ilmentyminen (kuva 4k) viittaa siihen, että IL-23:n induktio tapahtuu lamina propria:ssa niiden paikallisen kypsymisen ja MHCII:n hankkimisen aikana.

Koska CX3CR1:n ilmentymistaso tunnistaa MNP:iden erilliset osajoukot, toistimme analyysimme CX3CR1GFP/+-hiirillä. Infektoitumattomissa hiirissä havaittiin alhaisia konstitutiivisen Il23a:n tasoja MHCII+ monosyyteissä, CD103+ CD11b+ DC:ssä (Täydentävä kuva S4c,d) ja CD11b+ DC:ssä (Täydentävä kuva S4d). Il23a:n lisääntynyttä ilmentymistä 4 päivää Hh-infektion ja IL-10R:n eston jälkeen havaittiin kuitenkin johdonmukaisesti vain MHCII+ monosyyteissä (Täydentävä kuva S4d) ja makrofageissa (ei esitetty). Tulehduksen edetessä korkea Il23a:n ilmentyminen säilyi MHCII+-monosyyteissä ja niiden kehitysjälkeläisissä, mutta ei CD103+ DC:ssä (kuva 5a). CX3CR1int-alaryhmien joukossa Il23a:n ilmentyminen rajoittui edelleen CD64+-soluihin (kuva 5b).

Kokonaisuutena tietomme viittaavat siihen, että IL-23:n induktio paksusuolitulehduksessa sisältyy CX3CR1:tä ilmentäviin CD11c+-soluihin, jotka ilmentävät myös MHCII:tä ja CD64:ää.

Batf3-riippuvaiset CD103+ DC:t ovat tarpeettomia kroonisessa koliitissa

CD103+ CD11b+ DC:t löytyvät pääasiassa hiiren ohutsuolesta ja puuttuvat lähes kokonaan paksusuolesta.6 Sen sijaan useimmat paksusuolen CD103+ DC:t ovat CD11b- ja vaativat transkriptiotekijä Batf3:n kehittyäkseen.30 Batf3-/-hiiriltä puuttuvat siis kudosresidenssissä olevat CD8α+ ja CD103+ CD11b- ei-lymfaattiset DC-alaryhmät. Odotetusti CD103+ CD11b- solujen määrä väheni voimakkaasti Batf3-/-hiirten paksusuolen lamina propria-alueella, kun taas CD103+ CD11b+ DC:t olivat muuttumattomia (kuva 6a,b). Arvioidaksemme, voisivatko CD103+ CD11b- DC-solut olla osallisina koliitin kehittymisessä, infektoimme Batf3-/-hiiret Hh:llä yhdistettynä anti-IL-10R-hoitoon. Kahden viikon kuluttua koliitin alkamisesta CD103+ CD11b- DC:iden määrä oli edelleen merkittävästi vähentynyt lamina propria -alueilla (kuva 6b), mutta leukosyytti-infiltraatiossa (kuva 6c) tai koliitin vakavuudessa (kuva 6d) ei havaittu eroja Batf3-/-hiirillä verrattuna niiden villityyppisiin lajitovereihin, mikä osoittaa, että Batf3-riippuvaiset DC:t ovat tarpeettomia IL-23:n aiheuttaman suolistotulehduksen indusoimiseksi tässä mallissa.

Kypsät makrofagit tuottavat IL-23:a vastauksena H. hepaticus-stimulaatiota in vitro, mutta jakavat toiminnallisen redundanssin MHCII+-monosyyttien kanssa in vivo

Makrofagien osuuden selvittämiseksi IL-23:n tuotannossa tuotimme luuytimestä peräisin olevia makrofageja (BMDM) CD11cIL-23- ja CD11cIL-23+-hiiristä. Erilaistamisen jälkeen L929-soluilla ehdollistetulla väliaineella noin puolet BMDM:istä oli positiivisia Cre-GFP:n suhteen ja ilmentivät CD64:ää, F4/80:aa ja CD11c:tä (lisäkuva S5a). BMDM:iä stimuloitiin in vitro elävillä Hh-bakteereilla anti-IL-10R-vasta-aineen läsnäollessa, ja niiden vastetta verrattiin vastaaviin kontrolleihin. On silmiinpistävää, että CD11cIL-23+ BMDM:ien stimulointi Hh:lla johti Il23a:n mRNA:n ilmentymiseen, ja tämä vaste voimistui IL-10R-signaalin eston läsnä ollessa, kun taas Il23a ei ilmentynyt stimuloimattomissa BMDM:issä tai pelkällä anti-IL-10R-vasta-aineella käsitellyissä BMDM:issä (lisäkuva S5b). Vastaavasti hiirten infektio Hh:lla indusoi vain vähäisen IL-23:n purskeen monosyyteissä ja makrofageissa in vivo, ja tämä vaste voimistui voimakkaasti IL-10R-signalisaation puuttuessa (Täydentävä kuva S5c).

Suoliston kudosmakrofagit ovat peräisin yksinomaan veren monosyyteistä eivätkä uusiudu itsestään.8. KUVA S5c, 10 Pesäkkeitä stimuloivan tekijän 1 reseptorin (CSF-1R) signalointi kontrolloi Ly6Chi:n erilaistumista Ly6Clo-monosyyteiksi31 ja sitä tarvitaan paikallaan olevien Ly6Clo-monosyyttien ja kudosmakrofagien kypsymiseen ja korvautumiseen, mutta se on tarpeeton Ly6Chi-monosyyttien tuotannolle tai tulehdustoiminnalle.32 Arvioidaksemme MHCII+-monosyyttien ja kudosmakrofagien suhteellista osuutta IL-23-riippuvaisen suolistotulehduksen kehittymisessä esikäsittelimme CX3CR1GFP/+-hiiriä anti-CSF-1R:ää salpaavalla mAb:llä tai isotyyppikontrollilla ennen koliitin induktiota. Yksi ryhmä hiiriä analysoitiin päivänä 0 (lisäkuva S6a,b), kun taas loput hiiret hoidettiin Hh:lla ja anti-IL-10R:llä ja jatkoivat anti-CSF-1R-hoitoa. Neljän päivän kuluttua Hh-infektiosta ja anti-IL-10R-hoidosta makrofagit puuttuivat lähes kokonaan anti-CSF-1R-käsiteltyjen hiirten paksusuolesta. Myös heterogeeninen Ly6Clo CX3CR1int-makrofagi/DC-osasto väheni merkittävästi näissä hiirissä (kuva 7a,b ja lisäkuva S6c). Vaikka paksusuolen leukosyyttien kokonaismäärä ei muuttunut (kuva 7c), granulosyyttien osuus kasvoi näissä olosuhteissa (kuva 7d). Mielenkiintoista oli, että makrofagien väheneminen korreloi edelleen Il23a:n lisääntyneen ilmentymisen kanssa lamina proprian sisällä päivänä 4 (kuva 7e). Anti-CSF-1R-välitteinen makrofagien köyhdyttäminen koko koliitin keston ajan ei kuitenkaan vaikuttanut paksusuoleen kertyvien tulehdussolujen määrään (kuva 7f) tai suolistopatologian vakavuuteen (kuva 7g) 2 viikkoa Hh-infektion ja IL-10R-signaalin eston jälkeen, mikä viittaa siihen, että MHCII+-monosyytit ja makrofagit saattavat olla toiminnallisesti redundantteja tulehduksen aikana.