Yhdysvaltalaiset ja kanadalaiset asiakkaat voivat pyytää ILMAISEN NÄYTTEEN CTAB-pohjaisesta SYNERGY™ 2.0 Kasvien DNA:n uuttosarjastamme TÄÄLTÄ.
DNA:n eristäminen kasvien kudoksista voi olla hyvin haastavaa, sillä eri kasvilajien biokemian väliset erot voivat olla äärimmäisiä. Toisin kuin eläinkudoksissa, joissa eri lajeista peräisin olevilla samoilla kudostyypeillä on yleensä samankaltaiset ominaisuudet, kasveissa aineenvaihduntatuotteiden ja rakenteellisten biomolekyylien määrät voivat vaihdella. Polysakkaridit ja polyfenolit ovat kaksi kasvibiomolekyylien luokkaa, jotka vaihtelevat suuresti eri lajien välillä ja ovat erittäin ongelmallisia DNA:ta eristettäessä. Saastuttavat polysakkaridit ja polyfenolit voivat häiritä DNA:n käsittelyä eristämisen jälkeen.
On olemassa menetelmiä, joilla polysakkaridit ja polyfenolit voidaan tehokkaasti poistaa kasvien DNA-valmisteista. CTAB:n (setyylitrimetyyliammoniumbromidi), kationisen detergentin, käyttö helpottaa polysakkaridien erottamista puhdistuksen aikana, kun taas lisäaineet, kuten polyvinyylipyrrolidoni, voivat auttaa polyfenolien poistamisessa. CTAB-pohjaisia uuttopuskureita käytetään laajalti puhdistettaessa DNA:ta kasvikudoksista.
Eräs vaihtoehto DNA:n puhdistamiseksi CTAB:n avulla hyödyntää sitä, että polysakkaridien ja DNA:n liukoisuudet CTAB:hen vaihtelevat natriumkloridin pitoisuudesta riippuen. Suuremmissa suolapitoisuuksissa polysakkaridit ovat liukenemattomia, kun taas pienemmissä pitoisuuksissa DNA on liukenematon. Säätämällä suolakonsentraatiota CTAB:tä sisältävissä lysaateissa polysakkaridit ja DNA voidaan näin ollen saostaa eri tavoin.
Polyfenolit ovat yhdisteitä, jotka sisältävät useamman kuin yhden fenolirenkaan (esim. tanniini), rakenteen, joka sitoutuu erittäin tehokkaasti DNA:han. Niitä esiintyy luonnostaan kasveissa, mutta niitä syntyy myös kasvien kudosvaurioiden (ruskettuminen) yhteydessä. Kun kasvikudoksia homogenoidaan, polyfenolit syntetisoituvat vapautuneen polyfenolioksidaasin avulla. Polyvinyylipyrrolidonin lisääminen estää DNA:n ja fenolirenkaiden vuorovaikutuksen sitomalla polyfenoleja.
CTAB-pohjaiset protokollat toimivat yleensä hyvin, mutta yksi merkittävä haittapuoli on se, että orgaanisten liukoisten molekyylien erottamiseksi DNA:sta käytetään rutiininomaisesti kloroformiuutoksia. Koska kloroformi on karsinogeeninen, monet laitokset paheksuvat sen käyttöä. Näin ollen OPS Diagnostics on kehittänyt vaihtoehtoisen menetelmän, jossa kloroformia vältetään; se löytyy Synergy™ Plant DNA Extraction Kit -sivulta.
Materiaalit
- CTAB-puskuri: 2 % setyylitrimetyyliammoniumbromidia, 1 % polyvinyylipyrrolidonia, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA tai CTAB-uuttopuskuri
- Sentrifugi (jopa 14 000 x g)
- RNaasi A -liuos
- Isopropanoli
- 70 % etanoli
- 2 ml:n sentrifugiputket
- SpeedVac
- TE-puskuri (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Menetelmä
Kasvinäytteet voidaan valmistaa jauhamalla kudos kryogeenisesti morttelissa ja murskaimella sen jälkeen, kun se on jäähdytetty nestetypessä. Pakastekuivatut kasvit voidaan jauhaa huoneenlämmössä. Kummassakin tapauksessa hienojakoinen jauhe on parasta DNA:n uuttamista varten.
- Jokaista 100 mg homogenoitua kudosta kohti käytetään 500 µl CTAB-uuttopuskuria. Sekoita ja vorteksoi huolellisesti. Siirrä homogenaatti 60 °C:n kylpyyn 30 minuutiksi.
- Inkubaatioajan jälkeen sentrifugoi homogenaattia 5 minuuttia. 14 000 x g:n nopeudella.
- Siirrä supernatantti uuteen putkeen. Lisätään 5 µl RNaasiliuos A:ta ja inkuboidaan 37 °C:ssa 20 minuuttia
- Lisätään sama määrä kloroformia/isoamyylialkoholia (24:1). Vortexaa 5 sekuntia ja sentrifugoi näytettä 1 minuutti 14 000 x g:n nopeudella faasien erottamiseksi toisistaan. Siirretään vesipitoinen ylempi faasi uuteen putkeen. Toista uutto, kunnes ylempi faasi on kirkas.
- Siirretään ylempi vesifaasi uuteen putkeen. Saostetaan DNA lisäämällä 0,7 tilavuutta kylmää isopropanolia ja inkuboidaan -20 °C:ssa 15 minuuttia.
- Sentrifugoidaan näyte 14 000 x g:llä 10 minuutin ajan. Dekantoidaan supernatantti häiritsemättä pellettiä ja pestään sen jälkeen 500 µl:lla jääkylmää 70-prosenttista etanolia. Tyhjennetään etanoli. Poista jäljelle jäänyt etanoli kuivaamalla SpeedVacissa.
- Kuivaa pelletti riittävän kauan alkoholin poistamiseksi, mutta kuivattamatta DNA:ta kokonaan. Liuotetaan DNA 20 µl:aan TE-puskuria (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Pelletti saattaa joutua lämmittämään liukenemistaan.
Vaihtoehtoinen protokolla:
Siilidioksidin spin-kolonnien käyttö voi tuottaa laadukkaampaa DNA:ta. Valinnainen protokolla löytyy täältä.