DNA-metyylitransferaaseja (MTaaseja), jotka siirtävät metyyliryhmän S-adenosyylimetioniinista joko adeniini- tai sytosiinijäämiin, on monenlaisissa prokaryooteissa ja eukaryooteissa. Metylaatio on otettava huomioon, kun DNA:ta pilkotaan restriktioendonukleaaseilla, koska pilkkoutuminen voi estyä tai heikentyä, kun tunnistuskohdan tietty emäs on metyloitunut.
Prokaryoottinen metylaatio
Prokaryooteissa MTaasit on useimmiten tunnistettu restriktio-/modifikaatiojärjestelmien elementeiksi, jotka suojaavat isännän DNA:ta vastaavan restriktioendonukleaasin pilkkoutumiselta. Useimmat E. coli -lajin laboratoriokannat sisältävät kolme paikkaspesifistä DNA-metylaasia.
- Dam-metylaasi-metylaasi-metylaatio adeniinin N6-asemassa sekvenssissä GATC (1,2).
- Dcm-metyylitransferaasit-metylaatio toisen sytosiinin C5-asemassa sekvensseissä CCAGG ja CCTGG (1,3).
- EcoKI-metylaasi-metylaasi-metylaatio adeniinissa sekvensseissä AAC(N6)GTGC ja GCAC(N6)GTT.
Jotkut tai kaikki restriktioendonukleaasin tunnistuskohdat voivat olla resistenttejä pilkkoutumiselle, kun ne on eristetty Dam- tai Dcm-metylaaseja ilmentävistä kannoista, jos metylaasin tunnistuskohta on päällekkäin endonukleaasin tunnistuskohdan kanssa. Esimerkiksi Dam+ E. colista eristetty plasmidi-DNA on täysin resistentti GATC-kohtia pilkkovalle MboI:lle.
Ei kaikki E. colista eristetty DNA ole metyloitunut samassa määrin. Vaikka pBR322:n DNA on täysin modifioitu (ja siten täysin resistentti MboI:n pilkkomiselle), vain noin 50 % λ-DNA:n Dam-kohdista on metyloitunut, luultavasti siksi, että metylaasilla ei ole tilaisuutta metyloida DNA:ta kokonaan ennen kuin se pakataan faagin päähän. Tämän seurauksena Dam- tai Dcm-modifikaation estämät entsyymit tuottavat osittaisia sulatusmalleja λ-DNA:n kanssa.
Dam- tai Dcm-metylaation estämät rajoituskohdat voidaan vapauttaa metyloimasta kloonaamalla DNA:si dam-, dcm- E. coli -kantaan, kuten dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Rajoituskohteet voivat estyä myös, jos päällekkäisiä kohtia on olemassa. Tällöin osa Dam- tai Dcm-sekvenssistä muodostuu restriktioentsyymisekvenssistä, jota seuraa flanking-sekvenssi. Tämä tilanne on myös otettava huomioon restriktioentsyymidigestiä suunniteltaessa.
Eukaryoottinen metylaatio
CpG MTaasit, joita esiintyy korkeammissa eukaryooteissa (esim. Dnmt1), siirtävät metyyliryhmän sytosiinijäämien C5-asemaan. CpG-metylaatiokuviot ovat perinnöllisiä, kudosspesifisiä ja korreloivat geeniekspression kanssa. Näin ollen CpG-metylaatiolla on oletettu olevan merkitystä erilaistumisessa ja geeniekspressiossa (4).
Huomautus: CpG-metylaation vaikutukset aiheuttavat huolta lähinnä silloin, kun pilkotaan eukaryoottista genomista DNA:ta. CpG-metylaatiomallit eivät säily, kun DNA kloonataan bakteeri-isäntään.
Metylaatioherkkyys
Alla olevaan taulukkoon on koottu yhteenveto NEB:n restriktioentsyymien metylaatioherkkyydestä ja siinä ilmoitetaan, estääkö Dam-, Dcm- tai CpG-metylaatio pilkkomisen tai haittaako se pilkkomista tai ei haittaako se sitä, jos tai kun se on päällekkäin kunkin tunnistusalueen kanssa. Tätä taulukkoa olisi pidettävä pikemminkin ohjeena lueteltujen entsyymien käyttäytymisestä kuin absoluuttisena indikaattorina. Tutustu REBASE , restriktioentsyymitietokantaan, josta saat yksityiskohtaisempaa tietoa ja erityisiä esimerkkejä, joihin nämä ohjeet perustuvat.
- Marinus, M.G. ja Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E. ja Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. ja Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. ja Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legenda
| ● | Ei herkkä | ◆ | Haitallinen |
| ◼ | Suljettu | ◇ ol | Vammautunut päällekkäisyyksillä |
| ◻ ol | Suljettu päällekkäisyyksillä | ◇ scol | Vammautettu joillakin päällekkäisyyksien yhdistelmillä |
| ◻ scol | Suljettu joillakin päällekkäisyyksien yhdistelmillä | ||
Yksittäinen kirjain Koodi