Sanger-menetelmää käytetään DNA:n kohdepätkän monistamiseen, jotta DNA:n sekvenssi voidaan määrittää tarkasti. Reaktioventtiileihin lisättävien ddNTP:iden avulla yksinkertaisesti lopetetaan kasvavan DNA-juosteen synteesi, jolloin saadaan osittain monistuneita DNA-fragmentteja. Tämä johtuu siitä, että DNA-polymeraasi tarvitsee kasvavan ketjun 3′ OH-ryhmän ja saapuvan dNTP:n 5′ fosfaattiryhmän fosfodiesterisidoksen muodostamiseksi. Joskus DNA-polymeraasi sisällyttää ddNTP:n ja 3′ OH-ryhmän puuttuminen keskeyttää kondensaatioreaktion tulevan nukleotidin 5′ fosfaatin (pyrofosfaatin pilkkoutumisen jälkeen) ja kasvavan säikeen edellisen nukleotidin 3′ hydroksyyliryhmän välillä. Tämä kondensaatioreaktio tapahtuisi normaalisti, kun DNA-polymeraasi liittää modifioimattoman dNTP:n DNA:han. Yksinkertaisimmillaan 3′ OH-ryhmän nukleofiilinen hyökkäys johtaa nukleotidin lisäämiseen kasvavaan ketjuun. Jos 3′ hydroksyyliryhmä puuttuu, tämä nukleofiilinen hyökkäys estyy, jolloin DNA-polymeraasi ei pysty jatkamaan toimintaansa.
Tämä löydös johti sen sopivaan nimeen ”ketjun päättävät nukleotidit”. Dideoksiribonukleotideilla ei ole 3′ hydroksyyliryhmää, joten ketjun pidentymistä ei voi enää tapahtua, kun tämä dideoksinukleotidi on ketjussa. Tämä voi johtaa DNA-sekvenssin päättymiseen. Näin ollen nämä molekyylit muodostavat perustan DNA:n sekvensoinnissa käytettävälle dideoksiketjun lopetusmenetelmälle, jonka Frederick Sanger ja hänen työryhmänsä esittivät vuonna 1977 aikaisemman työn jatkeena. Sangerin menetelmä kuvattiin vuonna 2001 yhdeksi kahdesta perustavanlaatuisesta DNA-fragmenttien sekvensointimenetelmästä (toinen on Maxam-Gilbert-menetelmä), mutta Sangerin menetelmä on sekä ”laajimmin käytetty että useimpien automaattisten DNA-sekvensointilaitteiden käyttämä menetelmä”. Sanger sai toisen kemian Nobel-palkintonsa vuonna 1980 ja jakoi sen Walter Gilbertin (”heidän panoksestaan nukleiinihappojen emäsjaksojen määrittämisessä”) ja Paul Bergin (”hänen perustavanlaatuisista tutkimuksistaan nukleiinihappojen biokemiassa, erityisesti rekombinantti-DNA:n osalta”) kanssa, ja käsitteli dideoksinukleotidien käyttöä Nobel-palkintoluennossaan.
DNA:n sekvensointiEdit
Dideoksinukleotidit ovat käyttökelpoisia DNA:n sekvensoinnissa yhdessä elektroforeesin kanssa. DNA-näyte, joka käy läpi PCR:n (polymeraasiketjureaktio) seoksessa, joka sisältää kaikki neljä deoksinukleotidia ja yhden dideoksinukleotidin, tuottaa säikeitä, joiden pituus on yhtä pitkä kuin kunkin sen tyypin emäksen sijainti, joka täydentää tyyppiä, jossa on läsnä dideoksinukleotidia. PCR:ssä käytettävä taq-polymeraasi suosii ddGNTP:tä, mikä on havaittu useissa tutkimuksissa. Toisin sanoen jokaisella kyseisen tyypin nukleotidin emäksellä on todennäköisyys sitoutua deoksinukleotidin sijasta dideoksinukleotidiin, mikä lopettaa ketjun pidentymisen. Jos näyte sitten elektroforeesataan, siinä on kaistale jokaista pituutta kohti, jossa dideoksinukleotidin komplementti on läsnä. Nykyään on yleistä käyttää fluoresoivia dideoksinukleotideja siten, että jokaisella neljästä on erilainen fluoresenssi, joka voidaan havaita sekvenssilaitteella; näin ollen tarvitaan vain yksi reaktio.