Ei CAP1:n kohoavaa säätelyä, mutta kohonnut fosforylaatio S308/S310, havaittiin haimasyöpäsoluissa
CAP1-proteiinipitoisuudet määritettiin Western blotting -menetelmällä yleisesti käytetyistä haimasyöpäsolulinjoista {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 ja Mia PaCa-229}, ja niitä verrattiin kontrollointina toimivan kuolemattomaksi muuttuneen, mutta ei-transformoituneen haimasyövän solulinjan hTERT-HPNE30 proteiinitasoihin. Kuten kuvasta 1A käy ilmi, kaikki neljä syöpäsolulinjaa ilmentävät runsaasti CAP1:tä, mikä on verrattavissa HeLa-soluihin, joiden olemme aiemmin raportoineet ilmentävän runsaasti sekä CAP1:tä että CAP212:ta. Havaitsimme, että muuntamattomat hTERT-HPNE-solut ilmentävät CAP1:n tasoja, jotka ovat verrattavissa syöpäsolulinjojen tasoihin. Tutkimme myös toisen CAP-isoformin, CAP2:n, ilmentymistasoja ja havaitsimme, että PANC-1- ja Mia PaCa-2 -soluissa CAP2:n ilmentyminen oli huomattavasti lisääntynyt verrattuna hTERT-HPNE-soluihin (kuva 1A).
Haimasyövän soluissa havaittiin CAP1:n kohonnut S308/S310-fosforylaatio, mutta ei CAP1:n ylössäätynyttä ilmentymistä. (A) Western blot paljastaa, että kaikissa neljässä syöpäsolulinjassa havaittiin runsaasti CAP1:n ilmentymistasoja, jotka olivat verrattavissa HeLa-solujen ilmentymistasoihin, ja kontrollin haimasoluissa (hTERT-HPNE) CAP1:n ilmentymistaso oli samanlainen. CAP2-blot-tulokset osoittavat, että PANC-1- ja Mia PaCa-2 -syöpäsolut ilmentävät runsaasti CAP2-tasoja, jotka olivat huomattavasti korkeammat kuin kontrollin hTERT-HPNE-soluissa. (B) Western blot paljastaa kohonneen S308/S310-fosforylaation CAP1:ssä PANC-1- ja CFPAC-1-haimasyövän soluissa verrattuna transformoimattomiin hTERT-HPNE-haimasyövän soluihin. Fosforispesifinen vasta-aine tunnistaa fosforisignaalit molemmissa jäämissä. Ylhäällä olevat kohdistetut sekvenssit osoittavat sekvenssit, jotka ympäröivät tandem-fosforisäätelykohtaa. Tandem-kohdassa olevat seriinijäännökset (S307 & S309 hiiren CAP1:ssä; S308 & S310 ihmisen CAP1:ssä) on korostettu lihavoituna ja kursiivilla (myös alleviivattuna). Fosforisignaalit kvantifioitiin densitometrialla, ja kolmen kokeen tulokset analysoitiin Studentin t-testillä ja piirrettiin kuvaajaan, jossa virhepalkit edustavat S.E.M. ”*” tarkoittaa P < 0,05 ja ”**” tarkoittaa P < 0,01. (C) Solujen käsittely GSK3-inhibiittorilla 6-BIO 16 tunnin ajan vähensi merkittävästi CAP1-fosforylaatiota sekä PANC-1-haimasyövän soluissa että hTERT-HPNE-soluissa annosriippuvaisesti. 6-BIO vähensi CAP1-fosforylaatiota myös CFPAC-1-soluissa samalla tavalla (ei esitetty). GAPDH toimii lastauskontrollina Western-blottauksessa.
Raportoimme aiemmin, että GSK3 fosforyloi hiiren CAP124:n S309:ää (vastaa ihmisen CAP1:n S310:tä; linjatut sekvenssit esitetty kuvassa 1B). Ottaen huomioon raportoidun GSK3:n hyperaktivoitumisen haimasyövässä25 tutkimme CAP1:n S308/S310-fosforylaation mahdollista kohoamista syöpäsoluissa käyttämällä fosforispesifistä vasta-ainetta, joka tunnistaa molempien seriinijäämien fosforisignaalit Western blottingissa24. Mielenkiintoista oli, että S308/310-fosforylaatio oli merkittävästi kohonnut syöpäsoluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuva 1B, esitetty kvantifioiduilla tiedoilla vain PANC-1- ja CFPAC-1-solulinjojen osalta, mutta samanlaisia tuloksia saatiin AsPC-1- ja Mia PaCa-2-soluilla). Seuraavaksi estimme GSK3:n toimintaa käsittelemällä syöpäsoluja voimakkaalla GSK3:n estäjällä 6-BIO:lla (6-bromoindirubiini-3′-oksiimi)31 ja havaitsimme, että hoito vähensi CAP1:n S308/S310-fosforylaatiota PANC-1- ja CFPAC-1-soluissa annosriippuvaisella tavalla (kuva 1C, esitetty vain PANC-1-solujen osalta). Käsittely 6-BIO:lla vähensi CAP1:n fosforylaatiota myös kontrollien haimasoluissa. Johdonmukaisesti myös selektiivisempi GSK3:n estäjä, LiCl32, vähensi CAP1:n fosforylaatiota PANC-1- ja AsPC-1-soluissa, kuten myöhemmin esitetään. Nämä tulokset tukevat sitä, että GSK3 on myös osa CAP1:n fosforylaatiokoneistoa S308/S310-kohdassa haimasyöpäsoluissa. On myös huomattava, että syöpäsolujen ja kontrollisolujen käsittely 6-BIO:lla johti johdonmukaisesti tuntemattoman mekanismin kautta CAP1:n huomattavaan ylössäätelyyn.
Knockdown of CAP1 johti lisääntyneisiin stressisäikeisiin sekä vähentyneeseen syöpäsolujen liikkuvuuteen ja invaasioon
Seuraavaksi kokeilimme CAP1:n mykistämistä selvittääksemme CAP1:n rooleja haimasyövän syöpäsoluissa. Aiemmin kehittämämme vakaa knockdown-paradigma on yhteensopiva pelastusstrategian kanssa, jonka avulla voidaan todentaa CAP:n köyhtymisestä johdettujen fenotyyppien spesifisyys112,18,24. Käyttämällä kahta shRNA-konstruktiota S2 ja S3, jotka kohdistuvat itsenäisiin nukleotidisekvensseihin ja hiljensivät tehokkaasti CAP1:n HeLa- ja rintasyöpäsoluissa12,18,24,33, pystyimme tuottamaan stabiileja klooneja, joilla oli tehokas CAP1:n knockdown PANC-1- ja AsPC-1-soluissa, mikä vahvistettiin Western blotting -menetelmällä (kuva 2A). Kaksi stabiilia knockdown-kloonia, joista kumpikin oli peräisin PANC-1-soluista (S2-1 ja S3-3) ja AsPC-1-soluista (S2-3 ja S2-7), muodostettiin neomysiiniselektiolla. Yritykset hiljentää CAP1 CFPAC-1- ja Mia PaCa-2 -syöpäsolulinjoissa eivät kuitenkaan onnistuneet. CFPAC-1-solut eivät muodostaneet pesäkkeitä antibioottivalinnan jälkeen, kun taas Mia PaCa-2 -soluissa CAP1:n ilmentyminen ei ollut merkittävästi vähentynyt yhdessäkään noin kahdesta tusinasta seulotusta stabiilista pesäkkeestä (tietoja ei ole esitetty).
CAP1:n tukahduttaminen syövän syöpäsoluihin johti aktiini-stressisäikeiden voimistumiseen ja vähensi solujen motiliteettiä ja invasiota. (A) Tehokas CAP1:n knockdown kahdessa stabiilissa kloonissa kummassakin sekä PANC-1- että AsPC-1-soluissa, mikä vahvistettiin Western blottingilla. CAP1 havaittiin Western blottingissa, jossa GAPDH:ta käytettiin latauskontrollina. (B) CAP1:n köyhdyttäminen PANC-1-soluissa johti aktiinin stressisäikeiden lisääntymiseen. Kontrollisoluissa, jotka sisälsivät shRNA:n tyhjää vektoria (Vec), oli hyvin vähän aktiinin stressisäikeitä (merkitty nuolilla). Sitä vastoin CAP1-knockdown-soluissa (S2-1 ja S3-3) aktiinin stressisäikeet olivat lisääntyneet (merkitty nuolilla), kuten havaittiin fluoresenssimikroskopiassa Phalloidin-värjäyksen jälkeen. (C) CAP1:n vähentäminen vähensi sekä PANC-1- että AsPC-1-solujen liikkuvuutta, mikä havaittiin haavan paranemis- ja Transwell-migraatiomäärityksissä (vain PANC-1:n osalta). Transwellin migraatiomäärityksiä varten ~2 × 104 solua, joita oli näännytetty seerumilla yön yli, ladattiin kuhunkin inserttiin, joka oli sijoitettu seerumia sisältävällä väliaineella täytettyyn kuoppaan. Migroituneet solut pisteytettiin 16 tunnin kuluttua, ja tiedot kerättiin kolmesta riippumattomasta kokeesta, analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä ja piirrettiin kuvaajaan, jossa virhepalkit edustavat S.E.M. ”*” tarkoittaa P < 0,05 verrattuna tyhjää vektoria (Vec) sisältäviin kontrollisoluihin. (D) CAP1:n poistaminen vähensi Matrigel-invaasiota PANC-1-soluissa. Testit sekä tietojen kerääminen ja analysointi suoritettiin samalla tavalla kuin Transwell-migraatiomäärityksissä, paitsi että insertti-kalvot oli esipinnoitettu Matrigelillä. ”*” tarkoittaa P < 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. (E) Vähentynyt EMT CAP1 knockdown PANC-1-soluissa, mikä näkyy lisääntyneenä E-Cadherinin ilmentymisenä sekä vähentyneenä Vimentinin ilmentymistasona CAP1-knockdown-vakaissa klooneissa. GAPDH toimii lastauskontrollina Western-bloteissa.
Aluksi tarkastelimme morfologisia ja aktiinisytoskelettimuutoksia CAP1-knockdown PANC-1- ja AsPC-1-soluissa. Toisin kuin CAP1-knockdownin HeLa- ja metastaattisten rintasyöpäsolujen lisääntynyt solukoko12,18,24, CAP1:n poisto ei aiheuttanut havaittavaa kasvua PANC-1- tai AsPC-1-solujen koossa. Seuraavaksi värjäsimme PANC-1-solujen aktiinisytoskelettiä falloidiinilla, minkä jälkeen suoritimme fluoresenssimikroskopian. PANC-1-soluilla (ja haimasyövän soluilla yleensä) näyttää olevan huonosti järjestäytyneitä aktiinisytoskelettirakenteita, erityisesti stressisäikeiden osalta (kuva 2B), suhteessa aktiinisytoskelettitutkimuksissa yleisesti käytettyihin solulinjoihin, kuten HeLa- ja NIH3T3-fibroblasteihin12,24. CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa oli kuitenkin havaittavissa tehostuneita stressisäikeitä verrattuna kontrollisoluihin (Kuva 2B). Kaikissa tutkituissa 26 tyhjää vektoria sisältävissä kontrollisoluissa stressisäikeitä esiintyi hyvin vähän. Sitä vastoin 20:ssä tutkituista 27:stä (74,1 %) S2-1-solusta ja 18:ssa 23:sta (78,3 %) tutkitusta S3-3:n CAP1-knockdown-solusta oli huomattavan voimakkaita stressisäikeitä, kuten kuvassa 2B on esitetty. Stressisäikeiden kasaantumista on johdonmukaisesti havaittu muissa soluissa, joissa CAP1:tä on vähennetty12,13. Fenotyypin uskotaan johtuvan siitä, että CAP1 menettää sekä aktiinimonomeerejä sitovan että aktiinifilamenttien vaihtumista edistävän tehtävänsä.
Yhteensopivasti lisääntyneiden stressisäikeiden kanssa CAP1:n vähennyksen on raportoitu vähentävän liikkuvuutta useissa nisäkässolutyypeissä, mukaan luettuina syöpäsolut13,14,17,18,19. CAP1:n ohimenevän tyrehdyttämisen haimasyöpäsoluissa havaittiin myös vähentävän solujen liikkuvuutta haavanparannusmäärityksissä14. Testasimme vakaan CAP1:n knockdownin vaikutusta haimasyöpäsolujen invasiivisuuteen tekemällä haavanparannuskokeita, Transwell-migraatiokokeita ja Matrigel-invaasiokokeita. CAP1:n poistaminen vähensi merkittävästi solujen liikkuvuutta haavanparannusmäärityksissä sekä PANC-1- että AsPC-1-solujen osalta (kuva 2C), mikä vastaa aiemmin raportoituja tuloksia14. CAP1-knockdownin PANC-1-soluissa (sekä S3-3 että S2-1) haavat paranivat vain marginaalisesti 24 tunnin kuluttua käyttöönotosta, kun taas kontrollisoluissa aukko oli täyttynyt lähes kokonaan. Samanlaisia vaikutuksia havaittiin vakaissa CAP1-knockdown AsPC-1-klooneissa S2-3 ja S2-7 (kuva 2C). PANC-1-solujen Transwell-migraatiomäärityksistä saadut tulokset olivat yhdenmukaisia haavanparannusmäärityksistä saatujen tulosten kanssa, kuten alemmassa paneelissa olevasta kvantitatiivisten tulosten kuvaajasta käy ilmi (kuva 2C). Lisäksi invasiomääritykset paljastavat, että CAP1:n köyhdyttäminen vähensi myös PANC-1-syöpäsolujen kykyä tunkeutua ja tunkeutua Matrigelin läpi (kuva 2D). Kolmesta riippumattomasta kokeesta kerättyjen tietojen Studentin t-testin analyysit paljastavat, että CAP1:n vähentämisen aiheuttama invaasio on merkittävästi vähentynyt vakaissa PANC-1-soluissa (kuva 2D). Lopuksi, koska EMT (epiteliaalinen-mesenkymaalinen siirtymä) liittyy syöpäsolujen invasiivisuuteen, testasimme CAP1-kopioinnin mahdollista vaikutusta EMT:hen. CAP1-knockdownin PANC-1-soluissa E-Cadherinin määrä nousi, mikä viittaa vähentyneeseen EMT:hen (kuva 2E). Testasimme myös toista EMT-markkeria, Vimentiiniä, ja havaitsimme, että CAP1:n vähentäminen vähensi sen ilmentymistä (kuva 2E). Yhdessä nämä tulokset tukevat CAP1:n vaadittua roolia PANC-1-syöpäsolujen invasiivisuudessa ja EMT:ssä.
GSK3:n estäminen, joka estää CAP1:n fosforylaatiota, vähensi syöpäsolujen liikkuvuutta ja invasiota
Aiemmat havaintomme viittaavat siihen, että ohimenevä fosforylaatio on ratkaisevassa asemassa CAP1:n toiminnassa, kun se säätelee aktiinin sytoskelettiä24. CAP1:n kohonnut fosforylaatio haimasyöpäsoluissa, joka on yhdenmukainen aktivoituneen GSK3:n kanssa, viittaa siihen, että fosforisäätelyllä voi olla merkitystä myös CAP1:n toiminnalle syöpäsolujen invasiivisuudessa. Testasimme tätä mahdollisuutta estämällä GSK3:a, joka tukahduttaa S308/S310-fosforylaation ja samalla häiritsee CAP1:n säätelyä ohimenevällä fosforylaatiolla säätelykohdassa. PANC-1-soluja käsiteltiin 6-BIO:lla, minkä jälkeen tehtiin solujen migraatio- ja invasiomääritykset. Ensin testattiin S308/S310-fosforylaation vähenemisen vaikutuksia CAP1:een 5 μM 6-BIO:lla (kuva 1C). Kuten kuvasta 3A käy ilmi, 6-BIO-hoito vähensi merkittävästi PANC-1-solujen liikkuvuutta sekä haavanparannus- että Transwell-migraatiomäärityksissä. Vahvistimme myös, että PANC-1- ja AsPC-1-solujen käsittely toisella GSK3:n estäjällä, LiCl:llä, vähensi CAP1:n fosforylaatiota sekä solujen liikkuvuutta haavanparannusmäärityksissä (kuvat 3A,B). Lisäksi 6-BIO-hoito vähensi myös PANC-1-solujen Matrigel-invaasiota (kuva 3C). Koska GSK3:n tiedetään säätelevän monenlaisia solutoimintoja lukuisten substraattimolekyylien kautta, GSK3:n eston vaikutus solujen liikkuvuuteen on todennäköisesti kollektiivinen tuotos useiden GSK3:n kohteiden kautta, jotka osallistuvat sytoskeletin, solupolarisaation ja migraation säätelyyn34,35. Näin ollen testasimme ja vertasimme 6-BIO:n vaikutuksia solujen liikkuvuuden vähentämiseen CAP1-knockdown PANC-1-soluissa ja kontrollisoluissa. Kuten kuvassa 3D olevasta kuvaajasta käy ilmi, 6-BIO-hoito vähensi merkittävästi kontrollisolujen (Vec) motiliteettia mutta ei CAP1-knockdown-solujen (S2-1 ja S3-3) motiliteettia haavanparannusmäärityksissä. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat sitä, että S308/S310:n kautta tapahtuvalla fosforisäätelyllä on CAP1:lle tärkeä rooli haimasyöpäsolujen liikkuvuuden ja invasiivisuuden edistämisessä.
Kuvio 3
Syöpäsolujen motiliteettiä ja invasiivisuutta heikensi myös GSK3:n inhibitio, joka vähensi CAP1:n fosforylaatiota. (A) PANC-1-solujen käsittely 6-BIO:lla tai LiCl:llä vähensi solujen liikkuvuutta haavanparannus- ja Transwell-migraatiomäärityksissä. Käsittely 100 mM LiCl:llä vähensi tehokkaasti myös CAP1-fosforylaatiota PANC-1-soluissa. Transwell-migraatiomääritykset PANC-1-soluilla tehtiin samalla tavalla kuin kuvassa 2 on kuvattu, jossa NT tarkoittaa soluja ilman 6-BIO-käsittelyä. (B) Käsittely 100 mM LiCl:llä vähensi myös huomattavasti CAP1:n fosforylaatiota AsPC-1-soluissa sekä solujen liikkuvuutta haavanparannusmäärityksissä. (C) PANC-1-solujen käsittely 5 μM 6-BIO:lla vähensi merkittävästi syöpäsolujen invaasiota Matrigel-invaasiomäärityksissä. Matrigel-invaasiomääritykset, mukaan lukien tiedonkeruu ja analyysit, suoritettiin samalla tavalla kuin kuvassa 2D on kuvattu. (D) CAP1:n heikentäminen PANC-1-soluissa vaaransi 6-BIO:n vaikutuksen solujen liikkuvuuden vähentämiseen haavanparannusmäärityksissä. Kontrolli- ja CAP1-knockdown-vakaita PANC-1-klooneja viljeltiin 16 tuntia haavan asettamisen jälkeen, ja katkoviivat osoittavat alkuperäisen aukon reunat. Solujen liikkuvuus kvantifioitiin, analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä ja piirrettiin kuvaajaan, jossa virhepalkit edustavat keskihajontaa. ”*” tarkoittaa P < 0,05 ja ”**” tarkoittaa P < 0,01.
CAP1:n fosforimutanttien toiminnot olivat heikentyneet lisääntyneiden stressisäikeiden lieventämisessä ja lamellipodioiden kehittymisen edistämisessä CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa
CAP1-knockdown-soluista tekemämme havainnot tukevat sitä, että CAP1:tä tarvitaan syöpäsolujen motiliteettiin ja invasiiviin, ja GSK3:n estosta saadut tulokset viittaavat siihen, että S308/S310-fosforylaatiolla on keskeinen rooli CAP1:n toiminnoissa. Seuraavaksi käytimme uudelleenekspressiostrategiaa näiden tapausten selvittämiseksi. Villiä CAP1-tyyppiä (WTCAP1) ja fosforimutantteja, jotka jäljittelevät joko CAP1:n fosforyloituja (S307D/S309D; DD) tai fosforyloitumattomia (S307A/S309A; AA) muotoja, kuten aiemmin on kuvattu12,18,24, ekspressoitiin vakaana uudelleen CAP1:n katkaisemattomissa PANC-1-soluissa, jotta voitiin testata niiden kyvykkyys aktiinisytoskeletaalisen rakenteen ja solujen morfologisen fenotyypin pelastamiseen. Näissä mutanteissa on epäsuhta S3 shRNA:n kohdesekvenssiin, jotta knockdown-soluissa vakaana oleva shRNA ei tunnistaisi johdettuja mRNA:ita, mutta muuttamatta mitään CAP112:n aminohappoa. Pystyimme luomaan stabiileja klooneja, jotka ekspressoivat uudelleen WT-hiiren CAP1:tä tai AA- ja DD-fosforimutaatiota, mikä vahvistettiin Western blotting -menetelmällä 6xHis-tunnistetta vastaan (Kuva 4A). Huomaa, että alkuperäisestä Western blot -kuvasta oli poistettu kaksi epäolennaista kaistaa (näiden kahden kaistan näytteitä käytettiin vahvistamaan kahden seriini 36 -fosforimutaation uudelleenekspressio N-terminaalissa). Alkuperäisen Western blot -tuloksen koko sarja on esitetty täydentävässä kuvassa 1. AA- (AA-R) tai DD-mutanttia (DD-R) uudelleen ilmentävien solujen morfologiaa tutkittiin faasimikroskopialla ja verrattiin WTCAP1:tä (WT-R) uudelleen ilmentävien solujen morfologiaan. On raportoitu, että CAP1:n tyrmäys joissakin nisäkässolutyypeissä, kuten HeLa- ja metastaattisten rintasyöpäsolujen soluissa, johti solujen koon huomattavaan kasvuun12,13,18, ja tämän fenotyypin olemme aiemmin vahvistaneet olevan spesifinen CAP:n tyrmäykselle112,18. CAP1-knockdown PANC-1-soluissa tai AsPC-1-soluissa ei kuitenkaan osoittanut tätä vaikutusta. Pikemminkin WTCAP1:n tai fosforimutaatioiden vakaa uudelleenekspressio knockdown-soluissa itse asiassa kasvatti solujen kokoa merkittävästi (kuva 4B). Lisäksi WTCAP1:n uudelleenilmentäminen johti vankan kokoisten lamellipodioiden kehittymiseen (merkitty nuolilla), joka on alisolurakenne, jossa on runsaasti filamenttista aktiiniä ja joka on kriittinen solun liikesuunnan ohjaamisessa (kuva 4C), kun taas tyhjää kontrollivektoria sisältävistä knockdown-soluista käytännössä yksikään ei kehittänyt tällaisia lamellipodioita. Myös uudelleen ekspressoitu AA- tai DD-mutantti stimuloi jossain määrin lamellipodioiden muodostumista, mutta niiden koot olivat huomattavasti pienempiä kuin WTCAP1:tä uudelleen ekspressoivissa soluissa (merkitty nuolilla kuvassa 4C). Laskimme 200 solua kustakin solutyypistä, ja niiden solujen prosenttiosuudet, joissa oli suurikokoisia lamellipodioita, olivat: 0 % (0/200) knockdown-soluissa (Vec), 14,5 % (29/200) WT-R-soluissa ja 9 % (18/200) ja 7,5 % (15/200) AA-R- ja DD-R-soluissa.
WTCAP1:n ja fosforimutaatioiden uudelleen ilmentymisen vaikutukset CAP1-knockdown PANC-1-soluissa aktiinisytoskeletoon, solujen kokoon ja lamellipodioiden kehitykseen. (A) WTCAP1:n ja AA- ja DD-fosforimutaatioiden uudelleen ilmentymisen varmistaminen vakaissa S3-3 CAP1-knockdown PANC-1-soluissa Western blotting -menetelmällä käyttäen vasta-ainetta 6xHis-tagia vastaan. Alkuperäisestä Western blot -kuvasta oli poistettu kaksi epäolennaista kaistaa (esitetty täydentävässä kuvassa 1); (B) kvantifioidut tiedot, jotka osoittavat, että solujen solukoko kasvoi merkittävästi soluissa, jotka uudelleenekspressoivat WTCAP1:tä tai fosforimutaatioita CAP1-knockdown-soluissa. Koot 50 solua per kenttä mitattiin Image-J-ohjelmalla. Tiedot analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä ja piirrettiin kuvaajaan, jossa virhepalkit osoittavat keskihajonnan. ”*” tarkoittaa P < 0,05 verrattuna tyhjää vektoria (Vec-R) sisältäviin kontrollisoluihin. (C) Vaihekuvat osoittavat, että WTCAP1:n tai fosforimutaatioiden uudelleenekspressio stimuloi lamellipodian muodostumista. Osa WTCAP1:tä uudelleen ilmentävistä soluista (WT-R) kehitti erittäin suurikokoisia lamellipodioita (merkitty nuolilla). AA- (AA-R) tai DD-mutantin (DD-R) uudelleenilmentäminen simuloi myös lamellipodioiden muodostumista, mutta niiden koot ovat huomattavasti pienempiä kuin WTCAP1:tä uudelleenilmentävissä soluissa. Tällaisia lamellipodioita ei havaittu tyhjää vektoria (Vec-R) sisältävissä CAP1-knockdown-kontrollisoluissa. (D) WTCAP1:n uudelleenilmentäminen CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa vähensi stressisäikeitä, kun taas mutantteja uudelleenilmentävissä soluissa stressisäikeitä oli enemmän. Fosforimimeettistä DD-mutanttia uudelleen ilmentävillä soluilla oli eniten lisääntyneitä stressikuituja. Nuolet osoittavat stressisäikeitä tai niiden puutetta WT-R-solujen tapauksessa.
Seuraavaksi tarkastelimme fosforimutanttien kykyä lievittää lisääntyneitä stressisäikeitä CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa. Kuten kuvan 4D konfokaalikuvissa näkyy, WTCAP1:n (WT-R) uudelleenekspressio lievitti tehokkaasti tehostuneita stressisäikeitä ja pelasti siten fenotyypin, ja stressisäikeet liukenivat suurilta alueilta, jotka on merkitty nuolella. Sitä vastoin fosforimutaatiot eivät olleet yhtä tehokkaita tehostuneiden stressisäikeiden lievittämisessä. AA-mutanttia uudelleen ilmentävillä soluilla oli vaatimattomasti lisääntyneitä stressikuituja kuin WTCAP1:llä pelastetuilla soluilla, kun taas DD-mutanttia uudelleen ilmentävillä soluilla näytti olevan vielä enemmän lisääntyneitä stressikuituja. Nämä tulokset ovat johdonmukaisia aiempien HeLa-soluista tekemiemme havaintojen kanssa, jotka viittaavat siihen, että defosforyloitu CAP1 on ”aktiivinen” muoto suhteessa fosforyloituun CAP124:ään, kun taas ohimenevää fosforylaatiota uskotaan tarvittavan CAP1:n optimaalisten solutoimintojen kannalta. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että ohimenevä S308/S310-fosforylaatio on tärkeää CAP1:lle, jotta se voi säädellä aktiinisytoskelettiä haimasyöpäsoluissa; säätelyn häiritseminen ohimenevän fosforylaation kautta johtaa vikoihin CAP1:n toiminnassa aktiinifilamentin vaihtumisen edistämisessä.
CAP1:n fosforimutaatioissa oli puutteita, jotka pelastivat vähentyneen invasiivisuuden CAP1-knockdown-syöpäsoluissa
Koska dynaaminen aktiinifilamenttien liikevaihto on solujen liikkumisen ensisijainen liikkeellepaneva voima, testasimme seuraavaksi, kuinka hyvin fosforimutaatiot pelastavat vähentyneen solujen liikkuvuuden ja invasiivisuuden CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa. Suoritimme ensin Transwell-migraatiomääritykset ja havaitsimme, että WTCAP1:n uudelleenekspressio lisäsi merkittävästi solujen liikkuvuutta verrattuna tyhjää vektoria sisältäviin kontrollisoluihin, kuten kaavion kvantifioidut tulokset osoittavat (Kuva 5A). Uudelleen ekspressoitu AA-mutantti (AA-R), vaikka se ei ollut yhtä tehokas kuin WTCAP1, pelasti osittain solujen vähentyneen liikkuvuuden Transwellin migraatiomäärityksissä. Sitä vastoin DD-mutantti (DD-R) ei pelastanut vähentynyttä solujen liikkuvuutta, ja nopeus oli verrattavissa tyhjää vektoria sisältävien CAP1-knockdown-solujen nopeuteen. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa WTCAP1:n ja fosforimutaatioiden kykyjen kanssa pelastaa WTCAP1:n ja fosforimutaatioiden tehostetut stressikuidut. Testasimme lisäksi vähentyneen Matrigel-invaasion pelastamista CAP1-knockdown-soluissa, kuten kuvassa 5B esitetyt kvantifioidut tulokset osoittavat. Vastaavasti WTCAP1 pelasti vähentyneen invaasion CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa tehokkaimmin; AA-mutantilla saavutettiin osittainen pelastus, kun taas DD-mutantti ei kirjaimellisesti pelastanut fenotyyppiä. Lopuksi WTCAP1:n uudelleenekspressio CAP1-knockdown-soluissa vähensi myös E-Cadherinin ilmentymistä (kuva 5C), mikä tukee entisestään sitä, että CAP1:tä tarvitaan PANC-1-syöpäsolujen EMT:hen. Yhdessä nämä tulokset tukevat sitä, että S308/S310-tandemipaikan kautta tapahtuvalla fosforisäätelyllä on tärkeä rooli CAP1:lle haimasyöpäsolujen liikkuvuuden ja invaasion edistämisessä.
WTCAP1:n ja fosforimutanttien vaikutus CAP1:n vähentyneen liikkuvuuden ja invasiivisuuden pelastamisessa CAP1:n tyrehdytetyissä PANC-1-soluissa. (A) WTCAP1 ja AA-mutantti pelastivat tehokkaasti CAP1-knockdown-PANC-1-solujen vähentyneen liikkuvuuden Transwell-migraatiomäärityksissä, kun taas DD-mutantti epäonnistui tässä. Kokeet, tiedonkeruu ja analyysit suoritettiin samalla tavalla kuin kuvassa 2 on kuvattu. Virhepalkit edustavat S.E.M.:a, ja ”*” tarkoittaa P < 0,05 verrattuna tyhjää vektoria (Vec-R) sisältäviin kontrollisoluihin. (B) WTCAP1 ja AA-mutantti pelastivat tehokkaasti CAP1-knockdown-PANC-1-solujen vähentyneen Matrigel-invaasion, kun taas DD-mutantti ei myöskään onnistunut siinä. Kokeet, tiedonkeruu ja analyysit suoritettiin samalla tavalla kuin kuvassa 2 kuvattiin. Virhepalkit edustavat S.E.M., ja ”*” tarkoittaa P < 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. (C) WTCAP1:n uudelleenekspressio pelasti myös ylössäätyneen E-kadheriinin CAP1-knockdown-PANC-1-soluissa.
Todisteet, jotka tukevat sitä, että CAP1 välittää solunulkoisia kasvutekijäsignaaleja syöpäsolujen invasiivisuuden kontrolloimiseksi
Fysiologisten ärsykkeiden, kuten kasvutekijöiden PDGF ja HGF (hepatosyyttikasvutekijä)36, tiedetään stimuloivan aktiinisytoskeletin uudelleenjärjestäytymistä ja solujen siirtymistä. Koska S308/S310-kohdan fosforisäätely on ratkaisevan tärkeää CAP1:n toiminnalle aktiinisytoskeletin ja syöpäsolujen invasiivisuuden säätelyssä, tarkastelimme mahdollisuutta, että nämä ärsykkeet voivat säädellä CAP1:n fosforylaatiota ja sitä kautta säädellä aktiinisytoskeletin uudelleenjärjestäytymistä ja syöpäsolujen invasiivisuutta. Mielenkiintoista oli, että seerumin puutteessa olevien PANC-1- ja AsPC-1-solujen käsittely PDGF:llä vähensi CAP1:n S308/S310-fosforylaatiota, merkittävimmin 5 minuutin aikapisteessä (Kuva 6A,B). Haimasyöpäsolujen käsittely HGF:llä tai seerumilla ei vaikuttanut merkittävästi CAP1:n defosforylaation indusoimiseen (täydentävä kuva 2; esitetty PANC-1-solujen osalta). Siksi CAP1:n kautta tapahtuva signalointi on todennäköisesti ainakin osittain vastuussa siitä, että PDGF stimuloi aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestäytymistä ja syöpäsolujen invasiivisuutta. Nämä tulokset ovat myös johdonmukaisia sen käsityksen kanssa, että defosforyloitu CAP1 on ”aktiivinen” muoto, kuten useat todisteet osoittavat, mukaan lukien kofiliinin sitoutuminen, fosforimutanttien subcellulaarinen lokalisaatio ja CAP1:n kohonnut fosforylaatio suspensiossa viljellyissä soluissa24. CAP121:n optimaalisten solutoimintojen uskotaan kuitenkin edellyttävän ohimenevää fosforylaatiota tandem-säätelykohdassa eli vaihtelua fosforyloidun ja defosforyloidun muodon välillä4. CAP1-fosforylaatiosignaalit toimivat todennäköisesti yhdessä CAP1-fosforylaatiosignaalien kanssa CAP1:n solutoimintojen säätelyssä ohjaamalla ohimenevää fosforylaatiota S308/S310-kohdassa.
PDGF:n indusoima CAP1:n fosforylaation defosforylaatio haimasyövän soluilla. (A) Seerumin puutteessa olevien AsPC-1-syöpäsolujen käsittely PDGF:llä indusoi CAP1:n defosforylaatiota S308/S310-kohdassa. Soluja viljeltiin yön yli, niitä pidettiin seerumipulassa 24 tuntia, minkä jälkeen niitä käsiteltiin 30 ng/ml PDGF:llä ilmoitettujen aikojen ajan. Solulysaatit valmistettiin ja niitä käytettiin Western-blottaukseen fosforispesifisellä vasta-aineella, joka havaitsee fosforisignaalit CAP1:n tandem-säätelykohdan molemmissa jäännöksissä. Defosforylaatiovaikutus oli merkittävin PDGF-käsittelyn 5 minuutin aikapisteessä. (B) Seerumin puutteessa olevien PANC-1-solujen käsittely PDGF:llä aiheutti myös huomattavan CAP1:n defosforylaation samalla tavalla kuin AsPC-1-soluissa. Solujen käsittely ja Western-blottaus suoritettiin noudattaen samoja menettelyjä kuin AsPC-1-soluille. GAPDH toimi lastauskontrollina Western blotissa.
CAP1:n poistaminen haimasyöpäsoluissa vähensi FAK-aktiivisuutta, mutta ei aiheuttanut muutoksia ERK:ssa tai solujen proliferaatiossa
Osoitimme hiljattain CAP1:n uudenlaisen roolin rintasyöpäsolujen proliferaation säätelemisessä, jossa CAP1:n poistaminen vaikuttaa solukontekstista riippuvalla tavalla solujen proliferaation lisääntymiseen ja johon liittyy johdonmukaisia muutoksia ERK:n aktiivisuudessa18. Testasimme, voiko CAP1 säädellä ERK:ta ja proliferaatiota myös haimasyöpäsoluissa. PANC-1:n stabiileissa CAP1-nockdown PANC-1-klooneissa ei havaittu merkittäviä muutoksia ERK:n ilmentymisessä tai fosforylaatiossa verrattuna kontrollisoluihin (täydentävä kuva 3A). Teimme myös MTT-määrityksiä, joilla testasimme S2-1- ja S3-3-vakaiden knockdown-solujen proliferaatiota ja vertasimme niitä kontrollisolujen (Vec) proliferaatioon, ja havaitsimme hieman alentunutta solujen proliferaatiota knockdown-soluissa (Täydentävä kuva 3B). Erot olivat kuitenkin staattisesti merkityksettömiä, sillä S2-1-solujen ja kontrollisolujen välisen O.D.:n (570 nm:ssä) P-arvot olivat 0,219 ja S3-3-solujen ja kontrollisolujen välisen O.D.:n (570 nm:ssä) P-arvot olivat 0,223. Nämä tulokset osoittavat, että CAP1:llä ei ole merkittävää roolia haimasyöpäsolujen proliferaation säätelyssä. Kun lisäksi otetaan huomioon yleinen suuntaus, jonka mukaan stabiili knockdown-paradigma on altis kloonivaihteluille, loimme CAP1:n stabiilin knockdownin PANC-1-solujen poolit, joiden uskotaan heijastavan tarkemmin CAP1:n köyhdyttämisen vaikutuksia ERK:hon välttämällä valinnan harhan mahdollinen vaikutus. Kuten kuvasta 7A käy ilmi, sekä S2- että S3-shRNA-konstruktioista saadut stabiilit PANC-1-solut, joissa CAP1:n knockdown oli tehokasta, muodostettiin poolit neomysiinivalinnan jälkeen, mikä vahvistettiin Western blotting -menetelmällä. Vakaiden knockdown-kloonien käytöstä saatujen havaintojen mukaisesti knockdown-poolin soluissa ei havaittu merkittäviä muutoksia ERK:n ilmentymisessä tai sen fosforylaatiossa verrattuna kontrollipoolin soluihin.
CAP1:n knockdown-poolin PANC-1-solujen FAK-aktiivisuus ja solujen adheesio olivat vähentyneet mutta ERK:n ilmentymisessä ei ollut tapahtunut muutoksia. (A) CAP1-knockdown PANC-1 poolisoluissa, jotka olivat peräisin sekä S2- että S3-shRNA-konstruktioista, ei havaittu muuttunutta ERK:n ilmentymistä tai aktiivisuutta verrattuna tyhjää vektoria sisältäviin kontrollin poolisoluihin, kuten havaittiin Western blottingilla. ERK:n aktiivisuus havaittiin Western blottingissa käyttämällä Thr202/Tyr204-kohtien vasta-aineita vastaan suunnattua fosforispesifistä vasta-ainetta. GAPDH toimi latauskontrollina. (B) Vähentynyt FAK-aktiivisuus havaittiin CAP1-knockdown PANC-1 poolisoluissa verrattuna kontrollipoolisoluihin. FAK-aktiivisuus arvioitiin Tyr397-kohdan fosforylaation perusteella käyttämällä Western blottingissa fosforispesifistä vasta-ainetta kyseistä kohtaa vastaan; (C) CAP1-knockdown-poolisolujen solujen solujen adheesio oli heikentynyt testatuissa aikapisteissä (45 minuuttia ja 2 tuntia) sen jälkeen, kun solut oli istutettu fibronektiinilla päällystetyille levyille. Noin 2 × 104 solua sijoitettiin kuuden kuopan levyn kuhunkin kuoppaan, ja solut, jotka eivät olleet kiinnittyneet ilmoitettuihin aikapisteisiin, pestiin pois. Kiinnittyneiden solujen määrä laskettiin viidestä satunnaisesta kentästä faasimikroskoopilla ja otettiin kuvia. (D) Kolmesta riippumattomasta solujen adheesiomäärityksestä kerätyt tiedot analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä ja piirrettiin kuvaajaan, jossa virhepalkit edustavat keskihajontaa. ”**” Ilmaisee P < 0,01 verrattuna tyhjää vektoria kantaviin kontrollisoluihin.
CAP1:n vähentäminen rintasyöpäsoluissa aiheutti erillisiä muutoksia FAK:ssa metastaattisissa ja ei-metastaattisissa rintasyöpäsoluissa18. Havaitsimme myös vähentynyttä FAK-aktiivisuutta ilman muutoksia FAK:n ilmentymistasoissa CAP1-knockdown PANC-1-allasyöpäsoluissa (kuva 7B). Näiden tulosten perusteella testasimme edelleen CAP1-depletion vaikutuksia solujen adheesioon adheesiomäärityksissä samalla tavoin kuin aiemmin12,18. Havaitsimme, että molemmista shRNA-konstruktioista peräisin olevien CAP1-knockdown-poolisolujen solujen solujen adheesio oli huomattavasti vähentynyt verrattuna kontrollisoluihin (kuva 7C). Molemmissa aikapisteissä (45 minuuttia ja 2 tuntia) sen jälkeen, kun solut oli sijoitettu fibronektiinillä päällystetylle pinnalle, kiinnittyi huomattavasti enemmän kontrollisoluja kuin CAP1-knockdown-poolin soluja. Lisäksi useammat kiinnittyneistä kontrollisoluista olivat myös täysin levinneet (kehittyneet lamellipodiat ja solut eivät näy yhtä kirkkaina) verrattuna CAP1-knockdown-soluihin (kuva 7C). Pisteytimme kiinnittyneiden solujen lukumäärät kolmesta kentästä vertailua varten, ja kolmesta riippumattomasta kokeesta saadut tiedot kvantifioitiin, kuten kaaviossa on esitetty (Kuva 7D).