H5N1-influenssaviruksen aiheuttama subkliininen aivovamma

TEXT

Ihmisten influenssavirukset infektoivat tavallisesti ylähengityselimiä aiheuttaen aivastelua, nuhaa ja yskää sekä kuumeilua, huonovointisuutta ja nivelkipuja (22). Lisäksi on raportoitu myös neurologisia komplikaatioita, kun influenssaviruksen uusi alatyyppi leviää ihmisiin, kuten Espanjan (1918) ja Aasian (1957) pandemiat ovat osoittaneet (2-4, 6, 10, 18, 22).

Vuonna 1997 siipikarjasta peräisin oleva H5N1-influenssavirus aiheutti taudinpurkauksen ihmisissä. Sen jälkeen yli 500 ihmistä on saanut H5N1-virustartunnan maailmanlaajuisesti, ja kuolleisuus on ollut noin 60 prosenttia (21). Ihmisen H5N1-virusinfektio ilmenee yleensä vaikeana keuhkokuumeena, joka etenee akuutiksi hengitysvaikeusoireyhtymäksi; joillakin H5N1-viruksen uhreilla on kuitenkin ollut neurologisia oireita (1). H5N1-viruksen RNA:ta ja antigeenejä on havaittu potilaiden aivoissa, ja itse virusta on eristetty aivo-selkäydinnesteestä (5, 7). Nämä tiedot viittaavat siihen, että jotkin H5N1-virukset voivat aiheuttaa ihmiselle aivotulehduksen, kuten tapahtui Espanjan ja Aasian pandemioiden alkuvaiheissa.

Sarvikuonot ovat käyttökelpoinen nisäkäsmalli influenssatartunnalle, koska ne ovat erittäin alttiita influenssavirustartunnalle ja niille kehittyy joitakin ihmisillä esiintyviä influenssaoireita (8, 12, 14, 16, 19). H5N1-influenssaviruksen neuroinvasiivisuus intranasaalisen altistuksen jälkeen on raportoitu myös frettimallissa (23). Tutkiaksemme H5N1-virusinfektion pitkäaikaisia neurologisia vaikutuksia infektoimme siksi fretit H5N1-viruksilla, jotka aiheuttavat näille eläimille lieviä oireita, ja havainnoimme vaikutuksia keskushermostoon (CNS) 9 kuukauden ajan. Pyrimme myös selvittämään reitin, jota pitkin nämä H5N1-virukset tunkeutuivat keskushermostoon.

Kuusi kuukautta vanhat fretit inokuloitiin intranasaalisesti 106 PFU:lla A/Hongkong/483/1997- (H5N1; HK483) tai A/Hongkong/486/1997- (H5N1; HK486) virusta. Näitä viruksia lisättiin Madin-Darby canine kidney (MDCK) -soluissa minimaalisessa välttämättömässä väliaineessa, jota täydennettiin 0,3 prosentilla naudan seerumin albumiinilla. Päivinä 3, 6 ja 12 sekä kuukausina 1, 3, 6 ja 9 tartunnan jälkeen (p.i.) otimme kudosnäytteitä viruksen eristämistä ja patologista tutkimusta varten. Fretit olivat vaisuja ja niillä oli hengitystieinfektion merkkejä ja oireita ensimmäisten 10 päivän aikana p.i., mutta niillä ei ollut merkittäviä neurologisia oireita, mikä on ristiriidassa aiemmin raportoitujen tulosten kanssa (23). Kudosnäytteet nenäturbinaateista, keuhkoista, henkitorvesta, aivoista, maksasta, pernasta, munuaisista, sydämestä, haimasta ja selkäytimestä kerättiin ja homogenisoitiin 10-prosenttiseksi suspensioksi fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Virustitteri kussakin kudoksessa määritettiin plakkitesteillä. Virukset lisääntyivät pääasiassa nenän limakalvoissa, ja virustitterit saavuttivat 105-106 PFU/gramma kudosta 3-6 vuorokauden kuluttua (taulukko 1). HK483- tai HK486-tartunnan saaneista freteistä kerätyt aivokudokset säilöttiin 10-prosenttiseen neutraalipuskuroituun formaliiniin ja käsiteltiin parafiinipinnoitusta varten. Parafiiniin upotetut kudokset leikattiin 5 mm paksuiksi viipaleiksi ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E). Lisää leikkeitä leikattiin immunohistologista värjäystä varten kanin polyklonaalisilla vasta-aineilla H5-influenssavirusta vastaan. Histologinen tutkimus paljasti hermosolujen invaasiota tai vaurioita, mukaan lukien suonikalvopleksin tulehdus (taulukko 2). HK486-viruksella infektoiduissa freteissä oli havaittavissa 12 päivän ajan jatkunutta ei-suppuratiivista tulehdusta (kuva 1a) ja virusantigeenien ilmentymistä (kuva 1b); virusantigeenejä ei havaittu 1 kk:n kuluttua. Ei-suppuratiivinen enkefaliitti kesti 3 kuukautta (kuva 1c), ja jäännösglian arpeutumista oli havaittavissa 6 ja 9 kk:n kuluttua alueilla, joilla virusantigeenejä havaittiin aikaisemmassa vaiheessa (kuva 1d). Lisäksi HK486:lla tartunnan saaneilla freteillä havaittiin makroskooppisia vaurioita hajujärjestelmässä 12. päivänä i.p. (kuvat 1e ja f). Nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikka erittäin patogeeniset H5N1-virukset vaikuttavat pääasiassa isännän hengitysteihin (1), ne voivat aiheuttaa myös neurologisia komplikaatioita. Toisin kuin HK486-virus, joka tunkeutui frettien aivojen parenkyymiin ja aiheutti vakavia parenkyymivaurioita, toinen H5N1-kanta, HK483, aiheutti vakavan ei-suppuratiivisen vaskuliitin ilman ilmeisiä parenkyymivaurioita frettien aivoissa 6 vuorokauden kuluttua. Vaikka virusantigeenia ei voitu havaita verisuonistossa, verisuonivaurio oli ilmeinen, ja sille oli ominaista endoteelin turpoaminen (kuva 2a, nuolenkärjet), hajallaan olevat apoptoottiset solut (kuva 2b, nuolenkärjet) sekä makrofagien (kuva 2a, nuolet) ja polymorfonukleaaristen leukosyyttien (kuva 2b, nuoli) infiltraatio intramuraalisesti. Verisuonivaurioita todettiin talamuksessa, harmaan ja valkoisen aineen liitoskohdassa ja aivorungossa. Aivonäytteissä, jotka tutkittiin 1 ja 6 kuukautta i.p.i., näkyi verenvuotovaurioita, jotka viittasivat krooniseen ja toistuvaan perivaskulaariseen verenvuotoon (kuva 2c) talamuksessa, pikkuaivoissa ja etuaivojen subaraknoidaalitilassa (kuva 2d). Nämä havainnot vastaavat raportteja influenssaviruksen aiheuttamista verenvuotokomplikaatioista aivoissa vuosittaisten epidemioiden aikana (11). Virusinfektiosta johtuva aivojen vaskuliitti on suhteellisen yleinen (17), ja se on todennäköisesti syynä verisuonten seinämien haurauteen, joka johtaa aivoverenvuotoon. Siksi vaikuttaa järkevältä päätellä, että H5N1-virusinfektio ihmisillä voi aiheuttaa samanlaisen aivoverenvuodon kuin muiden neurotrooppisten virusten aiheuttamassa infektiossa.

Tutkiaksemme reittiä, jota pitkin H5N1-virukset tunkeutuvat frettien aivoihin, analysoimme HK483-, HK486-, A/Hongkong/213/2003- (HK213), A/Vietnam/1204/2004- (VN1204) ja A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004- (NCVD18) -viruksilla infektoiduilla freteillä havaittujen aivomuutosten jakautumista ja virusantigeenien ilmentymistä. HK213-, VN1204- ja NCVD18-viruksia lisättiin MDCK-soluissa minimaalisessa välttämättömässä väliaineessa, jota täydennettiin 0,3 prosentilla naudan seerumin albumiinia. Kuuden kuukauden ikäisiin fretteihin inokuloitiin intranasaalisesti 106 PFU virusta. Aivokudokset kerättiin akuutissa vaiheessa, 3 ja 6 päivää tartunnan jälkeen VN1204:n ja NCVD18:n osalta ja lisäksi 12 päivää tartunnan jälkeen HK213:n osalta. Kudokset käsiteltiin H&E-värjäystä ja immunohistokemiaa varten histologista tutkimusta varten. VN1204:n, NCVD18:n ja HK213:n aiheuttamille aivoparenkyymivaurioille oli ominaista ei-suppuratiivinen enkefaliitti, ja virusantigeenien ilmentymismalli oli olennaisesti sama kuin HK486:lla (tietoja ei ole esitetty). Ymmärtääksemme aivovaurioiden ja virusantigeenien kolmiulotteista (3D) jakautumista piirsimme ne 3D-kuvantamisella (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japani) keltamangustin (Cynictis penicillata) aivoista, joiden arkkitehtuuri muistuttaa läheisesti fretin aivoja (20). Hajuradan (eli hajuaistin aistiradan) visualisoimiseksi merkitsimme 3D-kuviin viitekehykseksi hermoradat hajupolvelta piriformiselle aivokuorelle (kuva 3a, keltainen; ks. myös Movie S1 lisämateriaalissa). Löysimme kolme erilaista mallia eri H5N1-influenssavirusten aiheuttamista aivovaurioista, joissa oli virusantigeenejä ja joissa ei ollut virusantigeenejä: ne, jotka jakaantuivat vain hajurataa pitkin (Kuva 3b ja c, katkoviiva keltainen viiva; ks. myös Elokuvat S2 ja S3) (HK213 ja NCVD18); ne, jotka havaittiin hajurataa pitkin (Kuva 3b ja c, katkoviiva keltainen viiva; ks. 3d ja e, katkoviiva; ks. myös elokuvat S4 ja S5) ja aivorungossa (kuva 3d ja e, valkoiset nuolet; ks. myös elokuvat S4 ja S5) (HK486 ja VN1204); ja muilla alueilla (kuva 3f; ks. myös elokuva S6) (HK483). Kolmannen vaurioryhmän erottaminen kahdesta muusta ryhmästä käy selvemmin ilmi, kun vauriojakaumia tarkastellaan takapuolelta (kuvat 3g ja h, keltainen vs. sininen vs. punainen). Nämä kartoitustulokset osoittavat, että useimmat testaamistamme H5N1-kannoista tunkeutuivat aivoihin hajuradan kautta (kuva 3, katkoviiva keltainen viiva). Yksi poikkeus oli HK483-kanta (kuva 3f), joka selvästi kohdistui frettien aivojen verisuonistoon ja aiheutti vaurioita hajujärjestelmän ulkopuolella.

Ennen kuin H5N1-viruksista voi tulla pandemia, niiden on todennäköisesti hankittava kyky kasvaa hyvin ihmisen hengitysteiden yläosassa, mikä johtaisi tehokkaaseen siirtymiseen ihmisestä ihmiseen aivastuksen ja yskimisen kautta (13, 22). Freteistä saamamme tiedot viittaavat siihen, että jos erittäin patogeeniset H5N1-virukset saavat tällaisen jalansijan ihmisissä, ne voivat aiheuttaa subkliinisiä neurologisia komplikaatioita tunkeutumalla aivoihin hermoratoja pitkin tai aiheuttamalla aivovaskuliittia. Aiemmin H3N2-virusta havaittiin frettien aivoissa; viruksen määrä aivoissa oli kuitenkin vähäinen (alle 102,2 log10 50 % munan tartunta-annoksia), eikä virusantigeenejä aivoissa havaittu (23). Havaitsimme, että vuoden 2009 pandemian H1N1-virus replikoitui tehokkaammin frettien hengitysteissä kuin ihmisen kausiluonteinen H1N1-virus (9, 13, 15) ja aiheutti nonsuppuratiivisia hajulohkovaurioita; emme kuitenkaan löytäneet virusta näiden eläinten aivojen parenkyymistä (tietoja ei ole esitetty). Aivoparenkyymiin tunkeutuminen, kuten virusantigeenien esiintyminen osoittaa, on siis H5N1-viruksille ominaista. Tämän vuoksi olisi aiheellista tehdä retrospektiivisiä ja prospektiivisia tutkimuksia H5N1-viruksen saaneiden potilaiden subkliinisten neurologisten komplikaatioiden varalta. Tuloksemme herättävät huolta siitä, että H5N1-virusten maailmanlaajuisen leviämisen yhteydessä vakaviin hengitystieinfektioihin saattaa liittyä subkliinisiä neurologisia komplikaatioita.