Integrin CD11b activation drives anti-tumor innate immunity

Integrin CD11b regulates macrophage polarization

Olemme aiemmin raportoineet, että VCAM-reseptori integriini α4β1 edistää myeloidisolujen rekrytoitumista luuytimestä kasvainmikroympäristöön ja stimuloi siten immunosuppressiota, angiogeneesiä ja kasvaimen progreditiota2,13,14,15. Toisin kuin sen rooli myelooisten solujen rekrytoinnin säätelyssä kudoksiin akuutin tulehduksen aikana16,17,18, havaitsimme, että CD11b (αMβ2), joka on myelooisten solujen integriinireseptori ICAM-1:lle ja fibrinogeenille, ei vaikuta myelooisten solujen rekrytointiin kasvaimiin, sillä CD11b:n globaalilla deleetioinnilla Itgam-/- -hiirissä ei ole mitään vaikutusta verenkierrossa olevien myelooisten solujen lukumäärään tai kasvaimiin rekrytoituneiden solujen lukumäärään (lisäkuvio 1; lisäkuvio 2 a-d). Yllättäen havaitsimme kuitenkin, että integriini CD11b:llä on olennainen rooli makrofagien polarisaation säätelyssä. Itgam-/–makrofageilla oli WT-makrofageihin verrattuna lisääntynyt immuunisuppressiivisten geenien ja proteiinien ilmentyminen ja voimakkaasti vähentynyt pro-inflammatoristen geenien ja proteiinien ilmentyminen riippumatta siitä, stimuloitiinko niitä perusolosuhteissa, IL-4- tai IFNγ/LPS-stimulaatio-olosuhteissa (kuva 1a, täydentävä kuva 2e-f). Määrittääksemme, sääteleekö CD11b myös makrofagien polarisaatiota in vivo, eristimme ja luonnehdimme F4/80 + TAM:t LLC:n kasvaimista, joita kasvatettiin Itgam-/- ja WT-hiirissä. Havaitsimme, että Itgam-/- TAM:t ekspressoivat myös merkittävästi korkeampia mRNA-tasoja, jotka liittyvät immuunisuppressioon ja angiogeneesiin, kuten Arg1, Tgfb, Il10, Il6 ja Pdgfb, ja merkittävästi alhaisempia mRNA-tasoja, jotka liittyvät immuunistimulaatioon, kuten Ifng, Nos2 ja Tnfa, kuin WT TAM:t (Kuva. 1b, lisäkuva 2g).

Tärkeää on, että CD11b:n ohimenevä siRNA-välitteinen tyrmäys in vitro viljellyissä makrofageissa nosti immunosuppressiivisten geenien ilmentymistä ja vähensi immunostimuloivien geenien ilmentymistä, vaikutukset, jotka ovat verrattavissa CD11b:n deletointiin (kuvio 1c), mikä osoittaa, että jopa ohimenevälläkin CD11b:n menetyksellä kontrolloidaan makrofaagien immuunisuppressiivisten geenien ilmentymistä. Selvittääksemme, kontrolloiko CD11b:n ilmentyminen tai toiminta makrofagien geeniekspressiota, tutkimme estävien CD11b-vasta-aineiden vaikutusta makrofagien mRNA-ekspressioon. Hiiren makrofagien CD11b-välitteisen kiinnittymisen estäminen ICAM-1:llä päällystettyihin substraatteihin anti-CD11b:tä neutralisoivilla vasta-aineilla indusoi myös immunosuppressiivista mRNA-ekspressiota makrofageissa (kuva 1d). Vastaavasti makrofagien kiinnittyminen integriini α4β1:n VCAM-1-substraattiin tai kiinnittymisen menettäminen suspensioviljelyn avulla edisti hiirien ja ihmisten immuunisuppressiivista transkriptiota, kun taas kiinnittyminen ICAM-1-pinnoitetuille pinnoille edisti immuunistimuloivaa transkriptiota (Kuva 1). 1e, f, Täydentävä kuva 1h), mikä osoittaa, että CD11b:n ligaatio kontrolloi immuniteettia stimuloivaa makrofagien transkriptiota.

Tulehdusta edistävien sytokiinien ilmentymisen häviäminen Itgam-/–makrofageissa viittasi siihen, että CD11b saattaa säädellä tulehdusta edistävien transkriptiotekijöiden, kuten NFκB:n, aktivaatiota. Havaitsimme, että Itgam-/–makrofageissa esiintyi vähentynyttä NFκB:n seriini 536 -fosforylaatiota (osoitus vähentyneestä aktivaatiosta19) vasteena LPS-stimulaatiolle verrattuna WT-makrofageihin, mikä viittaa siihen, että CD11b:llä on rooli NFκB:n aktivaatiossa (kuva 1g). Koska muut tutkimukset ovat osoittaneet CD11b:n osallistuvan monosyyttien ja dendriittisolujen pro-inflammatoristen vasteiden edistämiseen LPS:n suorien vuorovaikutusten kautta integriinin beeta2:n ekstrasellulaaristen domeenien kanssa20,21, tuloksemme viittaavat siihen, että CD11b:n aktivaatiolla ja signaloinnilla on keskeinen rooli makrofagien polarisaation säätelyssä in vitro ja in vivo.

Makrofagien CD11b säätelee kasvaimen kasvua

Tietomme osoittavat, että Itgam-/- luuytimestä peräisin olevilla ja kasvaimiin assosioituneilla makrofageilla on immuunisuppressiivisempia transkriptioprofiileja kuin WT-makrofageilla. Määrittääksemme, vaikuttaako tämä ero kasvaimen kasvuun, siirsimme adoptiivisesti WT- tai Itgam-/- luuytimestä peräisin olevia tai kasvaimeen assosioituneita makrofageja kasvainsolujen kanssa vastaanottajina oleviin WT- tai Itgam-/-hiiriin. Aiemmin olemme osoittaneet, että adoptiivisesti siirretyt, immuunisuppressiiviset BMDM- tai TAM- solut voivat stimuloida kasvaimen kasvua9,10. Huomionarvoista on, että luuytimestä peräisin olevat Itgam-/–makrofagit (kuva 1h) sekä kasvaimesta peräisin olevat Itgam-/–makrofagit (kuva 1i) stimuloivat voimakkaasti kasvaimen kasvua verrattuna WT-makrofageihin sekä WT- että Itgam-/-hiirissä. Koska Itgam-/- -makrofageilla on immuunijärjestelmää suppressiivinen transkriptioprofiili (kuva 1b) ja Itgam-/- -hiiristä peräisin olevilla kasvaimilla on yleinen immuunijärjestelmää suppressiivinen transkriptioprofiili (kuva 1j), nämä tiedot viittasivat siihen, että CD11b:n ilmentyminen tai aktivaatio saattaa vaikuttaa kasvaimen kokonaiskasvuun. Todellakin havaitsimme, että ihonalaiset (LLC), ortotooppiset (melanooma) ja autoktoniset (PyMT) kasvaimet kasvoivat aggressiivisemmin Itgam-/- kuin WT-hiirillä (kuva 1k). Koska Itgam-/-hiirillä oli kasvaimissa huomattavasti enemmän CD4 + Foxp3 + Treg-soluja ja vähemmän CD8 + T-soluja kuin WT-hiirillä (lisäkuva 3a-b), tutkimuksemme tukevat päätelmää siitä, että CD11b:llä on keskeinen rooli yleisen immuunivasteen säätelyssä kasvaimissa.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CD11b:n molekyylissä oleva isoleusiini 332 toimii allosteerisena kytkimenä, joka ohjaa adheesioreseptorin aktivaatiota ja muotoa22. Määrittääksemme, kontrolloiko CD11b:n aktivaatio kasvainten kehittymistä, loimme konstitutiivisesti aktivoituneen CD11b:n knockin -hiirikannan (C57BL/6 ITGAMI332G) tuomalla I332G-pistemutaation hiiren Itgam-geeniin. I332G knockin -hiiret ilmentävät normaaleja solupinnan CD11b-tasoja sekä monosyyteissä että granulosyyteissä, ja niillä on normaali kaikkien verisolujen taso (lisäkuva 3c-d). In vitro -adheesiomääritykset näiltä hiiriltä peräisin olevilla luuytimestä peräisin olevilla makrofageilla osoittivat, että I332G-solut ilmentävät konstitutiivisesti aktiivista CD11b:tä (täydentävä kuva 3e). Tärkeää on, että I332G Itgam knockin -hiirten LLC-kasvainten kasvu väheni merkittävästi (kuva 1k). Näin ollen, vaikka CD11b:n poisto stimuloi anti-inflammatorista makrofagipolarisaatiota, estää CD8+ T-solujen rekrytointia ja edistää kasvaimen kasvua, CD11b:n aktivointi estää voimakkaasti kasvaimen kasvua. Nämä tutkimukset osoittavat, että makrofagien CD11b:llä on kriittinen toiminnallinen rooli kasvaimen kasvun kontrolloinnissa.

Immunisuppressiiviset signaalit estävät CD11b:n ilmentymistä

Määrittääksemme, voivatko kasvaimen mikroympäristöön liittyvät signaalit muuttaa CD11b:n ilmentymistä ja sen jälkeen vaikuttaa myeloidisolujen polarisaatioon, arvioimme makrofagien väliaineiston (mCSF-, IL-4-, ja IFNγ/LPS- aineistoja sisältävien aineiden) vaikutusta solunpinnan CD11b:n ilmentymiseen luuytimestä peräisin olevissa makrofageissa. Immuunisuppressiivinen sytokiini IL-4 vähensi CD11b:n ilmentymistä, mutta pro-inflammatoriset ärsykkeet IFNγ/LPS lisäsivät CD11b:n pinnan ilmentymistä verrattuna mCSF-stimuloitujen makrofagien ilmentämiin tasoihin (lisäkuva 4a-b). Lisäksi immuunisuppressiivinen tekijä TGFβ, mutta ei IL-10, esti CD11b:n pintaekspressiota (lisäkuva 4c); TGFβ, IL-4 ja kasvainsolujen ehdollistettu väliaine (TCM) tukahduttivat kukin myös Cd11b:n mRNA-ekspressiota (lisäkuva 4d). Tärkeää on, että TGFβ ja TCM vähensivät CD11b:n solupinnan ilmentymistä ja stimuloivat immuunijärjestelmän suppressiivista transkriptiota samalla kun ne estivät immuunijärjestelmän stimuloivaa transkriptiota tavalla, joka kumoutui TGFβR1-inhibiittorilla SB525334 (lisäkuva 4e-g). Nämä tiedot osoittavat, että TGFβ:n kaltaiset sytokiinit kasvaimen mikroympäristössä tukahduttavat CD11b:n ilmentymistä tai aktivoitumista ja edistävät siten immuunisuppressiivista makrofagipolarisaatiota.

Makrofagien CD11b säätelee verisuonten vakautta

Makrofagit kontrolloivat immuunivasteiden lisäksi myös angiogeneesiä ja desmoplasiaa ilmentämällä sytokiinejä, kuten VEGF-A:ta ja PDGF-BB:tä, jotka ovat kasvutekijöitä, jotka säätelevät endoteelisoluja ja verisuonten sileitä lihaksia/perisyytejä angiogeneesin aikana, vastaavasti2. Kasvaimen verisuonet koostuvat usein yhdestä endoteelikerroksesta, josta puuttuvat tukevat perisyytit tai sileät lihassolut; näitä verisuonia on kasvaimissa enemmän kuin normaaleissa kudoksissa, mutta ne ovat poikkeavasti muodostuneita ja huonosti perfusoivia. Sitä vastoin kasvaimissa, joissa PDGF:n ja VEGF:n suhde on korkea, verisuonia reunustavat perisyytit, jotka ovat mesenkyymisoluja, jotka stabiloivat verisuonia ja edistävät kasvaimen parempaa perfuusiota23,24,25,26,27. Nämä kasvaimet kasvavat nopeammin kuin kasvaimet, joissa PDGF:n ja VEGF:n suhde on matalampi, mutta ne myös reagoivat paremmin kemoterapiaan ja immuunihoitoon kasvaimen paremman perfuusion ansiosta24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Koska Itgam-/- makrofageilla oli korkea PDGF- ja matala VEGF-geeniekspressio (kuvat 1a, b), tutkimme verisuonten kehittymistä Itgam-/- ja WT-kasvaimissa. WT- ja Itgam-/-hiirten LLC- ja PyMT-kasvainten verisuonikuvioiden arviointi osoitti, että Itgam-/–kasvaimissa oli vähemmän ja pidempiä verisuonia, joissa oli leveämmät luumenit ja vähemmän haarautumispisteitä/kenttä kuin WT-hiirten kasvaimissa (kuva 2a, b; lisäkuva 5a). Itgam-/–kasvaimissa oli enemmän verisuonia, jotka olivat Desmin+-, NG2+- tai SMA+-perisyyteillä/sileälihassoluilla vuorattuja kuin WT-kasvaimissa (Kuva 2a-c; Täydentävä kuva 5b). Vastaavasti nämä verisuonet olivat vähemmän läpäiseviä Itgam-/-hiirissä kuin WT-hiirissä, koska vähemmän intravaskulaarista FITC-dekstraania vuoti kasvainparenkyymiin (Kuva 2a-d). Nämä tiedot osoittavat, että integriini CD11b:llä on rooli verisuonten kypsymisen säätelyssä. Havaitsimme, että PDGF-BB:n mutta ei VEGF-A:n geeniekspressio lisääntyi voimakkaasti kasvaimissa (kuva 2e; täydentävä kuva 5c). Tärkeää on, että PDGF-BB:n proteiiniekspressio oli myös kohonnut Itgam-/- kasvaimissa ja kasvaimesta peräisin olevissa makrofageissa verrattuna WT-kasvaimiin (kuva 2f). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että makrofagien CD11b kontrolloi kasvainten verisuonistumista PDGF:n kohonneiden tasojen konstitutiivisen ilmentymisen kautta.

Tukena näille havainnoille CD11b:n rooleista neovaskularisaatiossa havaitsimme, että Itgam-/- -hiirillä esiintyi hyvin kehittynyt verkkokalvon verisuonipleksus (Kuva. 2g, Isolectin B+, vihreä) syntymähetkellä (P1) verrattuna WT-hiiriin, joilla on kehittymätön verkkokalvon verisuonisto, joka laajenee asteittain syntymän jälkeisestä päivästä 1 (P1) vuoteen P9. Pinnallinen verisuonipleksus oli kehittyneempi Itgam-/-hiirillä postnataalipäivästä P1 postnataalipäivään P9 kuin WT:n vastasyntyneillä (kuva 2g). Nämä tulokset osoittavat, että makrofageilla ja CD11b:llä on keskeinen rooli verisuonten normaalin kuvioinnin hallinnassa.

Tutkittaessa, onko kohonnut PDGF-BB vastuussa lisääntyneestä verisuonten kypsymisestä ja kasvainten kasvusta Itgam-/- -hiirissä, hoidimme WT- ja Itgam-/- -hiiriä, joilla oli LLC:n kasvaimia, imatinibilla, joka on PDGF-BB:n reseptorin PDGFR1:n estäjä. Imatinibihoito tukahdutti Itgam-/-hiirillä havaitun kasvaimen lisääntyneen kasvun (kuva 2h, i). Se myös lisäsi verisuonitiheyttä ja tukahdutti verisuonten normalisoitumista Itgam-/-hiirissä (kuva 2h, i). Yhdessä nämä tulokset tukevat käsitystä, jonka mukaan integriini CD11b moduloi verisuonten kehitystä kontrolloimalla PDGF-BB:n ilmentymistä.

CD11b säätelee Let7a:n ja c-Myc:n ilmentymistä

CD11b voi kontrolloida anti-inflammatorista makrofaagien polarisaatiota aktivoimalla transkriptiotekijöitä, kuten Stat3:aa, joka voi edistää immuunisuppressiivisten ja pro-angiogeneettisten tekijöiden, kuten arginaasi 1:n, Myc:n ja VEGF:n ilmentymistä37,38,39. Itgam-/–makrofageissa esiintyy konstitutiivisesti fosforyloitunutta Stat3:a (kuva 3a, sisäkuva); Itgam-/–makrofagien immunosuppressiivisten tekijöiden korkea ilmentyminen väheni WT-makrofagien tasolle, kun niitä hoidettiin Stat3:n estäjällä 5,15-DPP:llä (kuva 3a). Yllättäen Stat3:n esto ei kuitenkaan vaikuttanut Itgam-/–makrofageissa havaittuihin korkeisiin Il6-ekspressiotasoihin (kuva 3a). On tärkeää, että IL-6 voi suoraan aktivoida Stat338:n. Havaitsimme, että IL-6 edisti samaa immuunisuppressiivista polarisaatiomallia hiiren ja ihmisen myeloidisoluissa ja makrofageissa, jonka havaitsimme Itgam-/–makrofageissa (kuva 3b). Yhdessä nämä tulokset viittasivat siihen, että autokriininen IL6 voi ajaa Itgam-/–makrofageissa havaittua konstitutiivisesti immuunisuppressiivista polarisaatiota. Tämän käsityksen tueksi Il6:n knockdown vähensi konstitutiivisen Pdgfb:n ilmentymistä Itgam-/–makrofageissa (kuva 3c). Koska TAM:t ovat merkittävä Il6:n ilmentymisen lähde kasvaimissa15, nämä tulokset viittaavat siihen, että CD11b toimii luonnollisena jarruna immuunisuppressiolle osittain kontrolloimalla Il6:n myeloidisolujen transkriptiota.

MikroRNA:iden Let7-perhe voi kontrolloida Il6:n ilmentymistä kasvain- ja tulehdussoluissa40,41. MikroRNA:t ovat ei-koodaavia RNA:ita, jotka muokkaavat geeniekspressiota transkription jälkeisellä tasolla häiritsemällä RNA:n translaatiota tai stabiilisuutta, ja ne voivat vaikuttaa dramaattisesti kasvaimen immuunisuppressioon ja angiogeneesiin42,43. Havaitsimme, että miRNA Let7a:n ilmentyminen korreloi käänteisesti Il6:n ilmentymisen kanssa hiiren ja ihmisen makrofageissa (lisäkuva 6a-b). Siksi kysyimme, vaikuttaako CD11b-ekspression menetys makrofageissa Let7a-ekspressioon. Let7a:n ilmentyminen väheni Itgam-/- ja Itgam-siRNA:lla transdusoiduissa makrofageissa ja neutraloivien CD11b-vasta-aineiden läsnäollessa (kuva 3d; täydentävä kuva 6c) tavalla, joka oli riippumaton Lin28:sta, RNA:ta sitovasta proteiinista, joka pilkkoo ja inaktivoi Let7:ää, sillä CD11b:n ilmentyminen tai aktivoituminen ei vaikuttanut Lin28:n tasoihin (täydentävät kuvat 6b, d-e). CD11b:n ligaatio ICAM-1:llä edisti ajasta riippuvaista Let7a:n ilmentymistä ja esti samalla Il6:n ilmentymistä; päinvastoin adheesion tukahduttaminen esti Let7a:n ilmentymistä ja edisti Il6:n ilmentymistä sekä hiiren että ihmisen makrofageissa (kuvat 3e, f). Tärkeää on, että Let7a:n miRNA:n (pre-miRNA) ektooppinen ilmentyminen esti immuunisuppressiivista geeniekspressiota ja stimuloi pro-inflammatorista geeniekspressiota Itgam-/–makrofageissa, kun taas anti-miRNA Let7a stimuloi immuunisuppressiivista geeniekspressiota ja esti immuunia stimuloivaa geeniekspressiota WT-makrofageissa (kuva 3g). Samoin kuin CD11b:n ablaatio (kuva 1a), anti-miRNA Let7a stimuloi Pdgfb-ekspressiota, mutta sillä ei ollut vaikutusta Vegfa-ekspressioon (kuva 3h). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CD11b:n aktivaatio edistää miRNA Let7a:n ilmentymistä, joka puolestaan estää IL6-välitteistä immuunisuppressiivista makrofagigeenien ilmentymistä.

c-Myc, transkriptiotekijä, joka säätelee immuunisuppressiivista makrofagien polarisaatiota, sitoutuu Let7:n promoottoriin ja estää sen transkriptiota; mielenkiintoista on, että Let7 voi myös estää c-Myc:n ilmentymistä44,45. Havaitsimme, että c-Myc-geeni oli koholla Itgam-/- makrofageissa verrattuna WT-makrofageihin (kuva 3i). c-Myc-proteiinin ilmentyminen ja seriini 62 -fosforylaatio, joka stabiloi transkriptiotekijää46 , olivat myös koholla Itgam-/- makrofageissa verrattuna WT-makrofageihin (kuva 3j). Tämän jälkeen kysyimme, voisiko cMyc-toiminnan estäminen edistää Let7-ekspressiota ja siten muuttaa makrofagien polarisaatiota. Tärkeää oli, että Let7a:n, Let7d:n ja Let7f:n ilmentyminen väheni Itgam-/–makrofageissa; c-Myc:n farmakologinen inhibitio palautti kuitenkin Let7:n ilmentymisen Itgam-/–makrofageissa ja kumosi lisääntyneen immuunisuppressiivisen geenin ilmentymisen, jota Itgam-/–makrofageissa esiintyi (kuva 3k, l). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että integriini CD11b toimii tukahduttaen Myc-ekspressiota ja immuunisuppressiivista makrofagipolarisaatiota Let7-riippuvaisella tavalla.

Koska Let7a estää makrofagien välittämää Pdgfb-ekspressiota, tutkimme Let7a:n ilmentymisen vaikutusta neovaskularisaatioon in vitro ja in vivo. Endoteelisoluja ja verisuonten sileälihassoluja, jotka oli kiinnitetty mikrotukihelmiin, viljeltiin fibriinigeeleissä, jotka sisälsivät joko WT- tai Itgam-/–makrofageja, jotka transdusoitiin kontrolli-miRNA:lla, pre-miRNA Let7a:lla, anti-miRNA Let7a:lla tai Pdgfb-bb siRNA:lla. Itgam-/–makrofagit stimuloivat itujen pidentymistä, jota esti makrofagien transduktio Let7a-miRNA:lla tai Pdgfb-siRNA:lla (Kuva 4a, b; Täydentävä kuva 6f). Sitä vastoin anti-miRNA Let7a:n ilmentyminen WT-makrofageissa mutta ei Itgam-/–makrofageissa stimuloi verson pidentymistä (Kuva 4a, b; Täydentävä kuva 6f). Lisäksi anti-miR Let7a:lla transdusoidut makrofagit stimuloivat kypsien, pericyteillä päällystettyjen verisuonten muodostumista bFGF:llä kyllästetyssä Matrigelissa in vivo (Kuva 4c). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että CD11b kontrolloi neovaskularisaatiota Let7a:n ja sitä seuraavan PDGF-BB:n ilmentymisen säätelyn kautta.

Myeloidisolujen Let7a säätelee kasvaimen etenemistä

Testata Let7a:n roolia kasvaimen immuunisuppression ja neovaskularisaation säätelyssä, annostelimme anti-miR Let7a:ta kasvaimiin myeloidisoluihin kohdistetuissa nanohiukkasissa in vivo (Kuva. 4d). Havaitsimme, että integriini αvβ3-kohdennetut nanohiukkaset otettiin spesifisesti kiertävien myeloidisolujen käyttöön normaaleissa ja kasvainta kantavissa eläimissä (lisäkuva 7a-h). Anti-miRNA Let7a:n toimittaminen stimuloi LLC:n kasvaimen kasvua, joka oli verrattavissa Itgam-/-hiirillä havaittuun kasvuun (kuva 4d). Vaikka Let7a ilmentyy kasvainten immuunisoluissa ja ei-immuunisoluissa, havaitsimme, että anti-miRNA Let7a:n antaminen esti Let7a:n ilmentymistä vain kiertävissä monosyyteissä ja kasvaimeen liittyvissä makrofageissa, mutta ei muissa kasvaimeen liittyvissä soluissa (kuva 4e). Tärkeää on, että anti-miRNA Let7a stimuloi immuunisuppressiivista ja pro-angiogeenista geeniekspressiota ja esti pro-inflammatorista geeniekspressiota kasvaimissa kontrolleihin verrattuna (kuva 4f, lisäkuva 8a). Anti-miRNA Let7a stimuloi myös verisuonten normalisoitumista transfektoiduissa kasvaimissa, sillä verisuonet olivat pidempiä, vähemmän haaroittuneita, vahvasti perisyyteillä päällystettyjä ja vähemmän vuotavia kuin kontrollien transfektoiduista kasvaimista saadut verisuonet (kuvat 4g, h). Tärkeää on, että anti-Let7a tukahdutti myös CD8+ T-solujen rekrytoitumista kasvaimiin ja lisäsi CD4+ T-solujen rekrytoitumista kasvaimiin (kuva 4i). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CD11b hillitsee immuunisuppressiota ja verisuonten kypsymistä säätelemällä miRNA Let7a:ta. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt verisuonten normalisoituminen kasvaimissa voi parantaa kasvaimen perfuusiota ja edistää hoitovasteisuutta23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Määrittääksemme, voisiko anti-miRNA Let7a:n aiheuttama verisuonten normalisoituminen parantaa kemoterapian tehoa lisäämällä kasvaimen perfuusiota, hoidimme hiiriä, joilla oli LLC:n kasvaimia, kohdennetulla anti-miRNA Let7a:n tai kontrolli-miRNA:n annostelulla yhdessä kemoterapian (gemcitabiini) kanssa (kuva 4j). Vaikka anti-miRNA Let7a edisti LLC:n kasvaimen kasvua, anti-miRNA Let7a yhdistettynä gemsitabiiniin vähensi huomattavasti kasvaimen kasvua, mikä vastaa käsitystä siitä, että Let7a:n esto lisää kasvaimen saavutettavuutta kemoterapialle (kuva 4k). Näiden tulosten mukaisesti havaitsimme, että Itgam-/-hiirten gemcitabiinihoito tukahdutti kasvaimen kasvua voimakkaammin kuin WT-hiirten gemcitabiinihoito (lisäkuva 8b). Koska Itgam-/- hiirillä oli parempi perfuusio (vähemmän verisuonivuotoa) kuin WT-hiirillä (Täydentävä kuva 8c), nämä tutkimukset osoittavat, että CD11b:llä on vaikutustensa kautta miRNA Let7a:han kriittinen rooli kasvaimen immuunivasteen ja verisuonivasteen säätelyssä.

Cd11b-agonisti LA1 estää kasvaimen kasvua

Tuloksemme viittasivat siihen, että CD11b:n kohdennettu farmakologinen aktivointi in vivo saattaisi repolarisoida kasvaimeen assosioituneet makrofagit, minkä seurauksena kasvaimen immuunisuppressio ja kasvaimen kasvu estyvät. Näin ollen tutkimme CD11b:n pienimolekyylisen agonistin, leukadheriini 1:n (LA1)47,48 (kuva 5a), vaikutuksia makrofagien polarisaatioon ja kasvaimen kasvuun. LA1 stimuloi myeloidisolujen adheesiota ICAM-1:llä päällystettyihin substraatteihin tavalla, jota anti-CD11b:tä neutraloivat vasta-aineet estivät (kuva 5b). LA1 stimuloi makrofagien immuunivasteen geeniekspressiota, mikä näkyi Il1b-, Tnfa-, Il12-, Nos2- ja Ifng-mRNA:n ilmentymisen lisääntymisenä (lisäkuva 9a). Koska LA1 stimuloi Let7a:n ilmentymistä ja esti Pdgfb:n ja Il6:n ilmentymistä (kuva 5c), nämä tulokset viittasivat siihen, että LA1 saattaa stimuloida pro-inflammatorisia immuunivasteita, jotka voivat estää kasvaimen kasvua in vivo. LA1:n vaikutusten arvioimiseksi kasvaimeen liittyviin makrofageihin in vivo, kasvaimeen liittyvät makrofagit eristettiin10 , käsiteltiin LA1:llä ennen ja istutettiin yhdessä LLC:n kasvainsolujen kanssa. LA1:llä käsitellyt makrofagit estivät täysin kasvaimen kasvun (kuva 5d, e), vaikka LA1:llä ei ollut suoraa vaikutusta LLC:n tai makrofagien elinkykyyn (kuva 5e, f). Vaikka LA1:llä ei ollut vaikutusta CL66-Luc-rintakasvainsolujen kasvuun in vitro (lisäkuva 9b), LA1 vähensi tehokkaasti kasvaimen kasvua syngeenisissä, ortotooppisesti istutetuissa CL66-Luc-rintakasvaimissa tehokkaammin kuin taksoli (kuva 5g). LA1 vaikutti myös synergisesti säteilytyksen kanssa CL66-Luc-rintakasvainten kasvun tukahduttamiseen (kuva 5h) ja tukahdutti ortotooppisten, ihmisen MDA-MB-231-rintakasvainten kasvua (kuva 5i). Tärkeää on, että LA1 esti hiiren LLC-keuhkokasvaimen kasvua WT-hiirillä mutta ei Itgam-/-hiirillä, mikä osoittaa, että LA1 vaikuttaa integriini CD11b:n kautta tukahduttaen kasvainten kasvua (kuvat 5j, k).

Koska LA1-hoito lisäsi MHC-II+-makrofagien, joita tyypillisesti pidetään immuunikompetentteina, läsnäoloa ja vähensi CD206+-makrofagien, joita tyypillisesti pidetään immuunisuppressiivisina, läsnäoloa LLC- ja CL66-Luc-kasvaimissa (lisäkuva 9c-d), tutkimuksemme viittaavat siihen, että LA1 repolarisoi kasvaimiin assosioituneita makrofageja. Vastaavasti havaitsimme, että LA1 esti S100A8:n ja MMP9:n ilmentymistä CD11b+-soluissa LLC:n kasvaimissa ja esti myös Arginase1:n, S100A8:n ja MMP9:n ilmentymistä CL66-Lucin kasvaimissa (Täydentävä kuva 9e-f). Koska nämä proteiinit ovat pro-tuumoraalisten makrofagien merkkiaineita, yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että LA1 todennäköisesti estää kasvaimen kasvua repolarisoimalla kasvaimeen liittyviä makrofageja. LA1-hoito lisäsi CD8+ T-solujen esiintymistä sekä LLC- että CL66-Luc-kasvaimissa (lisäkuva 10a-c). Havaitsimme myös, että LA1-hoito muutti neovaskularisaatiota kasvaimissa vähentämällä SMA + -verisuonten määrää (kuva 5l). Tehostamalla kasvainten pro-inflammatorista immuuniprofiilia ja estämällä verisuonten normalisoitumista kasvaimissa pienimolekyylinen CD11b-agonisti LA1 muutti merkittävästi makrofagien polarisaatiota, lisäsi CD8+ T-solujen rekrytoitumista kasvaimiin ja esti kasvaimen etenemistä hiirimalleissa hiiren ja ihmisen syövässä.