Valmistuttuaan lääkäriksi Sorbonnen yliopistosta vuonna 1853 nivelreuman eri muotoja käsittelevällä väitöskirjalla Charcot työskenteli ensin yksityisvastaanoton omistajana ja vuodesta 1848 alkaen sairaalalääkärinä Salpêtrière-sairaalassa, jonka ylilääkäriksi hänestä tuli vuonna 1862. Vuonna 1872 hänestä tuli patologisen anatomian professori Pariisin yliopistossa, jossa hän julkaisi lukuisia teoksia hermoston anatomiasta ja patologiasta. Vuonna 1882 Pariisin Hôpital de la Salpêtrièreen perustettiin Charcot’lle maailman ensimmäinen hermoston sairauksien professuuri.
Vuonna 1883 Charcot hyväksyttiin Académie des sciences -akatemian jäseneksi. Vuosina 1888-1889 hän julkaisi kuuluisat Leçons du mardi -teoksensa, joissa hän esitteli kliinisiä tapauksia kansainväliselle lääkäreistä, toimittajista ja kirjailijoista koostuvalle yleisölle.
Kellään muulla 1800-luvun tiedemiehellä ei ollut yhtä pysyvää vaikutusta neurologian kehitykseen kuin Charcotilla. 1800-luvun 2. puoliskolla hän teki merkittäviä löytöjä lähes kaikilla neurologian aloilla. Hän kuvasi ensimmäisenä amyotrofisen lateraaliskleroosin ja neurogeenisen artropatian. Hän erotti myös multippeliskleroosin ja Parkinsonin taudin toisistaan itsenäisinä taudinkuvina.
7. kesäkuuta 1884 Charcot’n avustajan Raymond Combret’n, Pariisin teosofisen seuran jäsenen, välityksellä järjestettiin tapaaminen Salpêtrièressa teosofisen seuran Henry Steel Olcottin kanssa. Myöhempinä vuosinaan Charcot teki lähinnä psykopatologisia tutkimuksia hysteriasta. Vaikka joitakin hänen havaintojaan tarkistettiin myöhemmin, niillä oli suuri vaikutus psykiatrian kehitykseen ja hänen oppilaansa Sigmund Freudin psykoanalyysiin. Juuri Charcot’n kliininen hypnoosin käyttö hysterian orgaanisen syyn löytämiseksi herätti Freudin kiinnostuksen neuroosien psykologisiin syihin.
Freud opiskeli Charcot’n kanssa Salpêtrièressa elokuusta 1885 alkaen. Vaikka hän myöhemmin menestyksekkäästi vakiinnutti luomuksensa, psykoanalyysin, itsenäisenä tieteenä, usein unohdetaan, että se sai alkunsa Charcot’n hypnoositutkimuksesta. Charcotin muut tutkimukset hypnoottisen transsin aiheuttamista muuntuneista tajunnantiloista synnyttivät muita tieteenaloja, jotka eivät olleet yhtä sopusoinnussa materialistisen ajan hengen kanssa kuin Freudin tutkimus. Freud käänsi kaksi Charcot’n kirjaa ja varusti ne kriittisillä huomautuksilla.
Charcot edusti 1800-luvun vallitsevaa tiedettä, joka oli tullut toimeen hypnoosin kanssa, ja pyrki löytämään neurofysiologisen selityksen havaitsemilleen oireille. Hän etsi puhtaasti materialistista selitystä, jonka avulla helposti hypnotisoitavia henkilöitä voitaisiin pitää mielisairaina ja jonka avulla hypnoosin peräkkäiset vaiheet voitaisiin luokitella tarkasti. Vasta vuonna 1884 Hippolyte Bernheim ja Ambroise-Auguste Liébeault kyseenalaistivat hänen hypoteesinsa ja esittivät teorian, jonka mukaan hypnoottinen tila syntyy suggestion avulla, mikä lopulta todistettiin Liébeault’n lääketieteellisessä käytännössä. On käynyt ilmi, että Charcot’n usko siihen, että hypnoosilla oli patologisia syitä, johtui siitä, että hän sattui työskentelemään Salpêtrière-sairaalassa pääasiassa hysteerikkojen parissa. Charcot myönsi tappionsa muutama kuukausi ennen kuolemaansa julistamalla eräässä artikkelissa, että hysteerikot ovat periaatteessa helposti suggestion alaisia.
Charcot kuoli vuoden 1893 jälkeen angina pectoris -kohtaukseen.
Jean-Martin Charcot keräsi nuoruudestaan asti taiteellisesti lahjakkaana ja taiteesta kiinnostuneena lääkärinä historiallisia esityksiä hysteriasta. Hän otti myös käyttöön valokuvauksen yhtäältä kliinisen dokumentoinnin menetelmänä ja toisaalta didaktisena menetelmänä opetuksessa (diojen projisointi).
Charcot’n töitä kuvaa yksityiskohtaisesti Axel Munthe teoksessaan The Book of San Michele. Charcotista on myös yksityiskohtainen kuvaus Henri F. Ellenbergerin standarditeoksessa The Discovery of the Unconscious: History and Development of Dynamic Psychiatry from its Beginnings to Janet, Freud, Adler and Jung.
Muita Charcotin kuuluisia oppilaita olivat Georges Gilles de la Tourette, Joseph Babinski, Gheorghe Marinescu, Pierre Janet ja Charles-Joseph Bouchard.