Kattava näkemys ihmisen kromosomista 1

TULOKSET

PERUSTELUT JA CompView:n rakentaminen

Merkittävä määrä genomitietoa on talletettu useisiin tietokantoihin, mukaan lukien säteilyhybridi-pohjainen kartoitustieto (RHdb) (Lijnzaad ym. 1998), polymorfisten merkkiaineiden genotyyppitiedot (CEPHdb) (Dausset ym. 1990) ja EST-sekvenssi- ja klusteritiedot, jotka edustavat oletettuja ainutlaatuisia transkriptejä (UniGene) (Boguski ja Schuler 1995). Näitä tietokokonaisuuksia käytettiin karttojen kokoamisen perustana CompView-menettelyn avulla. Käytettävissä olevien markkereiden suuri määrä ylittää reilusti laskentaan perustuvien kartanrakennusmenetelmien kyvyn järjestää korkealla luotettavuudella enemmän kuin pieni osa markkereista. Sen vuoksi määrittelimme merkkien osajoukon (kehys) korkean luotettavuuden järjestyksen ja sijoittelimme loput merkit suhteessa tähän kehykseen. CompView käyttää iteratiivista prosessia (dynaaminen kehystäminen) lisätäkseen peräkkäin markkereita määritettyyn kehykseen ja maksimoidakseen siten kehysmarkkerien määrän ja kartan kokonaisresoluution.

Valitsimme CompView:n lähtökohdaksi joukon PCR-muotoisia markkereita, jotka pisteytettiin Genebridge4 (GB4) radiation hybrid (RH) -paneelissa (Gyapay ym. 1996), koska tämä on suurin julkisesti saatavilla oleva homogeeninen ihmisen genomisten markkereiden aineisto. RHdb:n ja UniGenen raakatiedot tuotiin Compdb:hen, joka on tätä hanketta varten kehitetty räätälöity relaatiotietokanta. Kaikki RHdb:n merkinnät, jotka on pisteytetty GB4-paneelissa ja määritetty kromosomille 1 (5557 markkeria), analysoitiin alukesekvenssi-identiteetin varalta ja koottiin 4442 yksilölliseksi markkerijoukoksi. Yksilöllisten markkereiden RH-tiedot analysoitiin sen jälkeen MultiMap-järjestelmällä, joka on asiantuntijajärjestelmä RH-karttojen automaattista rakentamista varten (Matise et al. 1994).

B4-paneelissa huolellisesti pisteytettyjen 62 Généthon-mikrosatelliittimarkkerin joukko toimi alustavana luurankokarttana kartan rakentamisen aikana. Luurankomarkkerit järjestettiin ≥1000:1 pareittain, ja RH:n ja geneettisen linkityksen määrittelemät järjestykset olivat täysin yhteneväiset. Kukin muu kuin luurankomarkkeri analysoitiin sitten luurankokarttaa vasten MultiMapin avulla sen määrittämiseksi, voitiinko se lisätä luurankokartan yksilölliseen paikkaan riittävällä tilastollisella tuella (≥1000:1). Lopullinen runko koostui 289 markkerista, jotka kattoivat 263 Mb:n kromosomin 1, jolloin keskimääräinen resoluutio oli 910 kb (kuva 1). Tämän jälkeen laskettiin kaikkien jäljelle jäävien merkkien 1000:1-todennäköisyysvälit suhteessa runkoon. Yhteensä 4220 yksilöllistä markkeria, jotka edustavat 5306 alukesarjaa, määritettiin kartalle (taulukko 1).

Näytä suurempi versio:

• Tässä ikkunassa
• Uudessa ikkunassa

• Lataa PowerPoint-diaesityksenä

Kuva 1. Markkerit ja merkkiaineet.

Kromosomi 1 RH:n runko. Viitekehyksen markkerit on lueteltu vaakasuoraan vasemmalta ylhäältä oikealle aloittaen 1p:n päätepisteestä. Markkerit on sijoitettu suhteessa niiden centiRay-asemiin. Sytolokaatiot on merkitty kunkin rivin alkuun. Likimääräinen fyysinen mittakaava on esitetty oikeassa alakulmassa.

Tietojen integrointi

RH-rungon 289 markkerista 111 oli polymorfisia ja ne oli genotyypitetty CEPH:n (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain) referenssiperimäpuissa (Dausset ym. 1990). RH-kehyksen rakentamista vastaavassa prosessissa näitä 111 markkeria käytettiin luurankokarttana geneettisen linkityksen (GL-kehyksen) rakentamiseksi. Kaikkia CEPHdb v8.1 -genotyyppitietokannan kromosomille 1 osoitettuja polymorfismeja käytettiin polymorfisten markkerien aineistona. Tuloksena saatu GL-kehys käsitti 160 markkeria, jotka oli järjestetty ≥1000:1-kertoimella ja joiden resoluutiot olivat 2,0 cM ja 1,6 Mb (taulukko 1). Lisäksi 628 polymorfista markkeria, mukaan lukien yleisesti käytetyt tetranukleotidiset ja intrageniset polymorfismit, jotka usein jätetään pois koko genomin kartoista, sijoitettiin sitten 1000:1 todennäköisyysväleihin suhteessa kehykseen. Mukaan otettiin myös 239 kromosomi 1 -spesifistä yhden nukleotidin polymorfismia (SNP), jotka oli pisteytetty GB4:ssä (Wang ym. 1998). Kaiken kaikkiaan GL- ja RH-tasot sisälsivät yhteensä 5008 yksilöllistä markkerisijoitusta, ja keskimääräinen markkeritiheys oli 52 kb (taulukko 1).

Sitten integroimme RH-tason, joka koostuu suurelta osin transkriboituja sekvenssejä edustavista markkereista, UniGenen EST-sekvenssiklustereihin (Boguski ja Schuler 1995). Klusterit ja kartoitetut RH-markkerit, joilla oli sama EST-sekvenssi, yhdistettiin toisiinsa. Kaiken kaikkiaan 4220 RH-markkerista 3543 (84 %) edusti transkriptioita, ja 2795 (79 %) näistä transkripteistä yhdistettiin yhteensä 1830 EST-klusteriin (taulukko 1).

Fyysistä kartoitustietoa yhdistettiin tunnistamalla markkereita, joille oli tunnistettu positiivisia PAC-, BAC- tai YAC-klooneja. Määritimme, sisältyikö kukin kartoitettu markkeri yhteen tai useampaan BAC- tai PAC-klooniin, jotka Sanger-keskus oli tunnistanut kromosomi 1:n sekvensointia varten (Gregory ym. 1998), ja integroitiin 6167 BAC/PAC-kloonia, jotka edustivat 1199 kromosomi 1:n markkeria (taulukko 1). Whitehead Institute Center for Genome Research (WICGR) on eristänyt YAC-kloonit, jotka sisältävät monia kartoitettuja markkereita (Hudson ym. 1995). Kromosomi 1:n YAC-klooneja lisättiin yhteensä 1930 kappaletta, jotka edustavat yhteensä 2275 markkeria kartalla. Olemassa olevien ja päällekkäisten markkerien määrä RH-, GL- ja fyysisten tasojen välillä on esitetty kuvassa 2 olevassa Venn-diagrammissa.

Kuvio 2.

Näytä suurempi versio:

• Tässä ikkunassa
• Uudessa ikkunassa

• Lataa PowerPoint-diaesityksenä

Kuvio 2.

.

Venn-kaavio merkkiaineiden alatyypeistä. Kaaviossa näkyy merkkiaineiden jakautuminen RH-, GL- ja fyysisten tasojen välillä ja niiden välillä. RH- ja GL-markkerijoukot on määritelty kaikista RH- ja GL-markkereista, joille on CompView:ssä osoitettu karttapaikat (n = 4220 ja n = 788). Fyysinen markkerijoukko määritellään niiden yksilöllisten markkerien lukumäärällä, joihin liittyy WICGR YAC ja/tai Sanger PAC/BAC (n = 2480), joista osajoukko (n = 1742) on paikannettu CompView:ssa.

Sytogeneettisen sijaintitiedon sisällyttämiseksi käytimme Genome Database (GDB) -tietokantaa (Letovsky ym. 1998) tunnistamaan 110 RH-tasomarkkerin joukon, jotka oli sytogeneettisesti lokalisoitu tietylle kromosomi 1 -kaistalle. Käyttäen näitä lokalisointeja sytogeneettisenä viitekehyksenä laskettiin sitten kaikkien jäljelle jäävien GL- ja RH-markkereiden sytologiset sijainnit. Yksittäinen kromosomikaista voitiin määrittää 54 prosentille (2686) sytolokalisoiduista markkereista; lopuille markkereille määritettiin sytogeneettinen kaistaväli.

Laajempien genomirakenteiden esittäminen edellyttää mekanismia redundanttien ja osittain redundanttien elementtien tunnistamiseksi. Koska RH-pohjaiset karttapaikat määräytyvät lyhyiden DNA-segmenttien monistamisen perusteella, ne voidaan esittää erillisinä genomipisteinä. Toiminnalliset genomielementit ovat kuitenkin usein subjektiivisemmin määriteltyjä. Näin ollen yksittäistä geeniä voi edustaa useita markkereita, jotka ovat jakautuneet laajalle genomialueelle, ja kukin markkeri vastaa erillistä karttapaikkaa. Integrointia vaikeuttaa myös markkerien nimikkeistö, sillä samalle genomielementille annetaan usein useita nimiä. Selkeyden vuoksi olemme laskeneet sekä kunkin erillisen markkerin tarkan sijainnin että toisiinsa liittyvien markkerien ryhmän, jota kutsutaan nipuksi, konsensusaseman.

Kaikista Compdb:ssä olevista markkereista koottiin kumulatiivinen luettelo tietokantatunnisteista (ID). Markkerit, joilla todettiin olevan yhteiset tunnukset (joilla oli periaatteessa sama nimi, sekvenssi tai EST-klusteri), ryhmiteltiin nipuiksi, jotka oletettavasti edustivat transkriptejä tai muita funktionaalisia genomielementtejä. Kukin nipun karttapaikka määriteltiin nipun muodostavien yksittäisten markkerien karttapaikkojen perusteella. Oletetaan esimerkiksi, että nipussa X on kolme markkeria, joiden väliset sijainnit ulottuvat kehysmerkkien 1-4, 2-5 ja 3-6 välille. Tällöin nipun X suurin sijainti olisi 1-6 ja pienin, todennäköisin karttapositio 3-4. Tällöin nipun X suurin sijainti olisi 1-6 ja pienin, todennäköisin karttapositio 3-4. Tietyt niput sisälsivät markkereita, joiden karttapositiot eivät olleet päällekkäisiä, mikä viittaa mahdollisiin virheisiin RH-pisteytyksessä, EST-klusterin muodostamisessa tai tunnisteiden merkitsemisessä. Näissä tapauksissa niput jaettiin sellaisten markkereiden osajoukkoihin, joiden karttapositiot olivat päällekkäiset. Neljäkymmentäkolme prosenttia (1796) markkereista voitiin koota 719 nipuksi, ja vähimmäiskarttapaikat määritettiin 89 prosentille nipuista. Niissä nipuissa, joissa oli määritelty vähimmäiskarttaväli, vähimmäiskarttaväli oli keskimäärin 1,4 Mb, kun taas keskimääräinen enimmäiskarttaväli oli 5,2 Mb. Tämä osoittaa, että niputusmenettelyllä voidaan merkittävästi kaventaa monien transkriptien todennäköisintä sijaintia yhdistämällä vastaavien markkereiden karttapositiot. Loput 76 nippua (11 %) sisälsivät markkereita, joiden karttapositiot eivät olleet päällekkäisiä, ja tämä prosenttiosuus kuvastaa suurelta osin RHdb- ja UniGene-tietueiden kumulatiivista virhetasoa. Näitä päällekkäisiä nippuja arvioidaan parhaillaan ristiriitaisten karttapaikkojen lähteen ja syyn selvittämiseksi.

Tietojen esittäminen

Tietojen esittämistä varten olemme kehittäneet CompView-internetsivuston (http://genome.chop.edu), joka tarjoaa graafisen ja tekstipohjaisen käyttöliittymän. Koko kromosomia (tai markkerien nimien tai sytogeneettisten kaistojen määrittelemiä osa-alueita) voidaan tarkastella graafisesti ja muokata interaktiivisen Java-sovelluksen Mapview (kuva 3) avulla (Letovsky ym. 1998). Yksittäisiä markkereita koskevat tiedot sisältävät alukesekvenssit ja RH-pisteet, tietokantatunnukset, EST-klusterien määritykset, johdetut sytogeneettiset sijainnit ja niihin liittyvät suuret inserttikloonit (kuva 4). CompView’ssa esitettyjen genomitietojen täydentämiseksi tarjotaan myös hypertekstilinkkejä ulkoisiin tietokantoihin. Tällä hetkellä mukana on suorat linkit 28 Internet-pohjaiseen tietokantaan, ja 19 tietokannasta on saatavilla erityisiä markkeritietoja (taulukko 2). Näihin kuuluvat linkit markkeri- tai sekvenssitietokantoihin, kuten dbSTS, dbEST, GenBank, UniGene, RHdb ja GDB; linkit yksittäisten laboratorioiden tai genomikeskusten markkeritietokantoihin; reaaliaikaiset kyselyt suurten kloonien seulontahankkeista; sekvenssihomologian haut BLASTin avulla; ja hakukoneiden kyselyt OMIM:n, BioHuntin ja GeneCardsin avulla (kuva 4). CompView’ssa esitetyt yksittäiset markkeritietueet toimivat siis tietoportaalina laajempaan joukkoon genomi-, sekvenssi- ja toiminnallisia tietoja, jotka ovat saatavilla muilla sivustoilla.

Kuva 3.

Näytä suurempi versio:

• Tässä ikkunassa
• Uudessa ikkunassa

• Lataa PowerPoint-diaesityksenä

Kuva 3.

Katso suurempaa versiota.

CompView Web-käyttöliittymän esimerkkejä. (A) Syöttönäyttö kromosomin alueen etsimistä varten. Alueet voidaan määritellä kahden vierekkäisen markkerin avulla (vasemmalla), klikkaamalla sytogeneettistä kaistaa kromosomin ideogrammista (oikealla) tai valitsemalla yksi tai joukko sytogeneettisiä kaistoja (ei kuvassa). Näytetään D1S468:n ja D1S214:n välistä aluetta koskeva kysely. (B) Taulukkomuotoinen palautus kyselylle D1S468-D1S214 fromA. Kunkin markkerin tyyppi, transkriptiotilanne, RH-väli, RH-kartan sijainti ja sytolokaatio esitetään kunkin markkerin kohdalla, ja kunkin markkerin kohdalla on hyperlinkki täydellisempiin tietoihin. Attop esitetään kunkin merkkiainetyypin löydettyjen merkkiaineiden kokonaismäärä. Klikkaamalla oikeassa yläkulmassa olevaa ”map of region” -painiketta saadaan C. (C) Graafinen palautus kyselystä D1S468-D1S214 Mapview:llä tarkasteltuna. Tässä esimerkissä näkyvät vain RH-puitteet (vasemmalla) ja osa RH-merkkien tasosta (oikealla). CentiRay-etäisyydet 1pteristä näkyvät kehyksen oikealla puolella. Välillä olevien RH-merkkien edessä on pystysuora viiva, joka osoittaa niiden 1000:1-todennäköisyysaseman suhteessa RH-kehykseen. Kyselyyn käytetyt markkerit on korostettu viitekehyksessä, samoin kuinGNB1:n RH-markkeri; GNB1:tä klikkaamalla saadaan kuvassa 4 esitetty markkeritietue.

Näytä suurempi versio:

• Tässä ikkunassa
• Uudessa ikkunassa

• Lataa PowerPoint-diaesityksenä

Kuva 4.

Kuva 4.

.

Merkkitietue-esimerkki. Kuvassa on yksilöllinen tietue geenilleGNB1. Alleviivattu teksti osoittaa hypertekstilinkin. Esimerkissä on ulkoiset tietokantalinkit dbEST- (ks. lyhenteet taulukon 2 legendasta), GDB-, Sanger-, GenBank-, UniGene- ja RHdb-tietueisiin tälle markkerille; BLAST-haun suorittamiseksi GenBankin ei-redundantti- (GenBank), EST- (EST) ja korkean läpimenoprosentin genomisekvenssikokoelmista (HTGS); tehdä hakuja GeneCards-, OMIM- ja BioHunt-tietokannoista hakusanalla ”GNB1”; ja etsiä Sanger-keskuksen kromosomi 1 -kartoitustietokannasta Acedb1 BAC- ja PAC-kartoituksia, joissa on GNB1-alkusekvenssit. Painikkeilla ”MAP OF GNB1” (GNB1:n kartta) ja ”GNB1 REGION” (GNB1:n alue) saadaan graafinen kuva GNB1:tä ympäröivästä alueesta kuvan 3 mukaisesti ja taulukkomuotoinen yhteenveto kaikista markkereista, jotka kartoittavat tätä aluetta kuvan 3 B mukaisesti. Vasemmalla luetellut tietoluokkien nimet (kuten ”Expression status”) ovat hyperlinkkejä luokkaa kuvaaville ohjesivuille.

Moniin markkereihin liittyy useita nimiä, ja tietyn lokuksen redundanttisen nimikkeistön lajittelu on usein työlästä. Sopivien markkerinimien valitsemiseksi loimme algoritmin, joka valitsee kuhunkin markkeriin liittyvien tietokantatunnusten joukosta sopivimman markkerinimen ennalta määritellyn nimilähdehierarkian mukaisesti. Niput nimettiin samalla tavalla valitsemalla kunkin nipun sisällä olevista markkerin nimistä.

Tietojen eheys

Ennustetun markkerijärjestyksen tarkistaminen on ratkaiseva vaihe kartan rakentamisessa. RH- ja linkitystasojen rakentamisessa käytetyt laskentamenetelmät perustuivat standardikartta-algoritmeihin, jotka ovat osoittautuneet luotettaviksi tarkan markkerijärjestyksen kannalta (Matise ym. 1994; Dib ym. 1996; Langston ym. 1999). Käytimme myös useita sisäisiä ja ulkoisia vertailuja kartoitusmenetelmämme eheyden arvioimiseksi. Sisäistä vertailua varten analysoimme ensin huolellisesti luurankokartan selvittääksemme, oliko RH-määritelty markkerijärjestys sopusoinnussa geneettisen linkitysanalyysin ennustaman järjestyksen kanssa. Lisäksi RH-kehystä varten jokainen markkeri poistettiin yksitellen ja kartoitettiin sitten uudelleen paikannuksen varmistamiseksi riittävällä tilastollisella varmuudella. Lisäksi vertailimme kaikkien sekä linkitys- että RH-kehykseen sijoitettujen markkerien sijainteja. Kaikissa sisäisissä vertailuissa käytännöllisesti katsoen kaikki markkerien sijainnit vastasivat toisiaan. Ulkoista tarkistusta varten vertasimme tuloksiamme aiemmin julkaistuihin kromosomi 1 -karttoihin. Meidän 289 RH-kehysmarkkerimme järjestystä verrattiin vastaaviin asemiin GeneMap96 RH (Schuler ym. 1996), GeneMap98 RH (Deloukas ym. 1998) ja Généthon version 3 GL -kartoissa (Dib ym. 1996). GDB:stä saadun sytogeneettisen viitekehyksen tarkkuus määritettiin vertaamalla sitä 212:een kromosomi 1:n suuren insertin klooniin, jotka Sanger-keskus oli sytogeneettisesti kartoittanut valmistellessaan sekvensointia. Kukin vertailu osoitti, että >90 prosenttia markkereista oli yhdenmukaisia. Lähes kaikki eroavaisuudet osoittautuivat yksittäisiksi, ja ennustamamme markkerien sijainnit olivat yleensä vierekkäin muiden karttojen sijaintien kanssa ja koskivat yleensä markkereita, joiden sijoitukselle oli heikko tilastollinen tuki. Lopuksi vertasimme markkeriemme järjestystä aiemmin julkaistujen karttojen 1p35-36 (Jensen ym. 1997) ja 1q41-43 (Weith ym. 1995) ennustamiin järjestyksiin. Yhteisesti kartoitettujen markkerien yhteneväisyysprosentti oli 94 % distaalisen 1p-kartan kanssa ja 100 % distaalisen 1q-kartan kanssa. Kaiken kaikkiaan nämä vertailut viittaavat vahvasti siihen, että CompView-menetelmä on luotettava ja että markkerien sijainnin yksittäiset vaihtelut johtuvat todennäköisemmin virheistä tietojen tuottamisessa tai syöttämisessä kuin kartan rakentamisessa.

Kromosomi 1:n analyysi

Kromosomi 1:n tulosten useita näkökohtia analysoitiin tarkemmin. 289 RH-kehysasemasta 182 (63 %) osoitettiin lopullisesti lyhyeen varteen. Tämä yliedustus johtuu todennäköisesti siitä, että RHdb:ssä on suurempi määrä 1p-spesifisiä RH-markkereita, mikä puolestaan johtuu siitä, että Sanger-keskus on valikoivasti kohdentanut 1p:n STS:n tuottamista varten kromosomi 1:n sekvensoinnissa (Gregory ym. 1998). RH-etäisyydet mitataan senttisäteinä, joita pidetään yleisesti verrannollisina fyysiseen etäisyyteen (Cox ym. 1990). Kuitenkin paisuneita RH-karttaetäisyyksiä havaittiin sentromeerisillä ja viereisillä 1q:n heterokromaattisilla alueilla (RH-kehikon paikatD1S2696-D1S3356; keskimääräinen etäisyys 27,5 cR vs. 12,7 cR koko kehikossa; P < 0,001), mikä vastaa aiempia havaintoja sentromeerisistä alueista (Benham ym. 1989; Cox ym. 1990; Walter ym. 1994). Lisäksi havaittiin useita muita alueita, joilla runkomarkkerin ja centiRayn välinen etäisyys oli pieni, erityisesti alueilla 1p35 ja 1q43 (kuva 1). Nämä alueet saattavat edustaa paikallisia alueita, joilla markkerien peittävyys on heikko tai joissa radioresistenssi on lisääntynyt, sillä molemmat alueet ovat päällekkäin tummien sytogeneettisten kaistojen kanssa (ks. jäljempänä). Vaikka telomeerispesifistä STS:ää ei ole vielä saatavilla 1p:lle, hiljattain tunnistettu 1q-spesifinen markkeri (TEL1q-10) (Hudson ym. 1995; Dib ym. 1996) esiintyy RH-tasossamme, ja sen karttaväli sisältää 1q-telomeerin. On tärkeää kiinnittää tuleviin RH-karttoihin telomeerimarkkereita sitä mukaa kuin niitä tulee saataville.

Kevyitä Giemsa-värjäytyviä sytogeneettisiä kaistoja pidetään yleensä transkriptiorikkaina (Bernardi 1989). Määrittääksemme, päteekö tämä periaate kromosomissa 1, laskimme niiden transkriptien lukumäärän, jotka oli määritetty nimenomaan vaaleisiin ja tummiin kaistaleisiin sytogeneettisessä tasossamme. Yhdelle kaistalle kartoitetuista 1883 transkriptistä 1663 (88,3 %) oli osoitettu vaaleille kaistoille (taulukko 3). Kun kunkin kaistan suhteellinen koko oli otettu huomioon, kuten aiemmin määritettiin murtopituusmittausten avulla (Francke ja Oliver 1978), havaittiin, että vaaleat kaistat sisälsivät keskimäärin 1,7 kertaa todennäköisemmin transkriptiota kuin vastaavan kokoiset tummat kaistat, ja vaalea kaista 1q21 oli transkriptipitoisin. Yleisestä suuntauksesta oli kuitenkin useita huomattavia poikkeuksia, kuten suuri transkriptitiheys tummalla kaistalla 1p31 ja pieni tiheys vaaleilla kaistoilla 1p32, 1p22, 1q23, 1q31 ja 1q42.