Kimera oli kreikkalaisessa mytologiassa olento, joka oli yleensä leijonan, vuohen ja käärmeen yhdistelmä. Termin ”kimerismi” nykyaikainen käyttö hematopoieettisten solujen siirroissa juontaa juurensa tästä ajatuksesta ”sekoittuneesta” olennosta, jolla viitataan henkilöön, joka on saanut siirteen geneettisesti erilaisesta kudoksesta. Hematopoieettisen kantasolusiirron jälkeisessä kimerismitestissä tunnistetaan vastaanottajan ja luovuttajan geneettiset profiilit ja sen jälkeen arvioidaan sekoittumisen laajuus vastaanottajan veressä, luuytimessä tai muussa kudoksessa.
DNA:n avulla tehtävässä kimerismitestissä (engraftment-analyysissä) käytetään menetelmiä, joita käytetään yleisesti ihmisen identiteettitestauksessa, ja se tehdään analysoimalla genomipolymorfismeja, joita kutsutaan lyhyiksi tandemtoistoistoiksi kutsutuiksi (short tandem repeat, STR). Nämä lokukset koostuvat DNA:n ydinsekvenssistä, joka toistuu vaihtelevan monta kertaa erillisen geneettisen lokuksen sisällä. Termi STR, johon viitataan myös nimellä mikrosatelliitit, viittaa tandemisesti toistuvan DNA-ydinsekvenssin emäsparien määrään, jonka pituus vaihtelee 2-8 emäsparin välillä. Näillä lokuksilla on alleeleja, joiden pituus voi vaihdella yksilöiden välillä, ja ne periytyvät codominantteina Mendelin ominaisuuksina. STR-lokuksia on tunnistettu kaikkialla ihmisen genomissa, ja joillakin lokuksilla on yli 25 alleelia.
Lokusten konservoituneilla rinnakkaisalueilla olevaa DNA-sekvenssitietoa käytetään STR-lokusten oligonukleotidialoitinparien luomiseen. Näitä alukkeita käytetään testinäytteiden PCR (polymeraasiketjureaktio) -monistuksessa. Tällä tekniikalla STR-sekvenssi voidaan monistaa jopa miljardi kertaa, jolloin saadaan materiaalia, joka voidaan erottaa toisistaan elektroforeettisella geelillä tai kapillaarielektroforeesilla (CE). Genotyypitys tehdään arvioimalla DNA-fragmenttien kokoa. STR-alleelien tarkkaan tunnistamiseen voidaan käyttää viittausta alleeliportaaseen.
PCR-pohjaisella STR/CE-järjestelmällä on useita etuja muihin analyysimenetelmiin verrattuna. Useiden STR-loosien monistaminen voidaan yhdistää (multipleksoida) yhteen putkeen, mikä mahdollistaa jopa kuudentoista loosin analysoinnin yhdessä reaktiossa. Koska tarvitaan pieniä määriä DNA:ta, voidaan käyttää näytteitä, joiden solumäärä on pieni, ja STR-alleelien pieni koko mahdollistaa jopa hajonneiden DNA-näytteiden käytön. Digitaalinen data helpottaa analysointia ja arkistointia, ja CE-prosessi on sekä nopea että kustannustehokas. STR-loosien PCR-monistaminen ja analyysi tarjoaa nopean ja luotettavan menetelmän elinsiirtotilanteen arvioimiseksi kantasolusiirroissa.
Nykyisin käytössä oleva tekniikka mahdollistaa kuudentoista lokuksen rinnakkaismonistamisen ja kolmivärisen osoittamisen, jotka on jaettu kolmeen viiden tai kuuden lokuksen ryhmään, joissa on monistettuja fragmentteja, joiden kokoalueet eivät ole päällekkäisiä.
PCR-monistamisvaiheessa monistetut fragmentit merkitään fluoresoivilla väriaineilla. PCR-monistuksen jälkeen näytteet käsitellään kapillaarielektroforeesijärjestelmässä (CE).
Tietojen analysointia helpottaa fragmenttianalyysiohjelmisto, joka määrittää DNA-fragmenttien koon näytteen kanssa ajetun sisäisen kaistastandardin avulla ja määrittää genotyypit vertaamalla niitä CE-ajoon sisältyvään STR-alleeliportaaseen. Näin saadaan erilliset STR-genotyyppiprofiilit luovuttajalle ja siirteen vastaanottajalle. Näiden henkilöiden välillä polymorfisia (eli informatiivisia) STR-looseja käytetään arvioitaessa vastaanottajan ja luovuttajan DNA:n suhteellisia määriä elinsiirron jälkeisessä näytteessä.
Testattavat näytteet voivat olla mistä tahansa DNA:ta sisältävästä materiaalista, mukaan lukien luuytimestä, perifeerisestä verestä, kiinteistä kasvaimista, orvaskeden kudoksesta, hiusfollikkelista, sylkiupotuspyyhkäisystä ja fraktioiduista solujoukoista. Koska näytteen PCR-monistaminen suoritetaan rutiininomaisesti alle 2 ng:lla genomista DNA:ta (vastaa noin 300 solua), kimerismitestaus tällä menetelmällä voidaan tehdä menestyksekkäästi myös potilaille, joilla on siirto epäonnistunut, joilla on vakava leukopenia tai jotka ovat peräisin hematopoieettisten solujen alaryhmien fraktioista. STR-analyysiä on käytetty arvioitaessa sellaisten potilaiden verensiirtotilannetta, jotka ovat saaneet hematopoieettisen solusiirteen, mukaan lukien potilaat, jotka ovat saaneet kaksinkertaisen napanuoraveriluovuttajan yksikön tai toisen siirteen eri luovuttajalta, sekä vahvistettaessa oletettujen identtisten kaksosten geneettistä identiteettiä ja havaittaessa äidin solujen siirtyminen kohdunsuuhun potilailta, joilla on diagnosoitu vaikea yhdistetty immuunipuutos (Severe Combined Immunodeficiency, SCID). STR/CE-analyysi on nopea, luotettava, tarkka ja toistettavissa oleva menetelmä.
Määrityksen rajoitukset
- Testinäytteistä on eristettävä riittävästi DNA:ta, jotta PCR-monistaminen on mahdollista. DNA:n eristysmenetelmien on oltava käytettävissä alhaisen soluluvun näytteiden käsittelyyn, joita voi esiintyä esimerkiksi siirteen epäonnistuneilla vastaanottajilla ja virtaussytometriassa linjaspesifisesti lajitelluista valkosolujen osajoukoista. Näytteiden pitoisuudet voivat olla liian alhaisia kvantifioitaviksi UV-spektrofotometrialla OD260. 5 000-30 000 eristetyn solun DNA-näytteet tuottavat luotettavasti hyväksyttävän monistumisen. Laboratoriolla on ohjeet, joissa määritellään, milloin näyteanalyysi on toistettava.
- Kaupallisilla sarjoilla monilla STR-lookseilla on informatiivisia alleeleja sekä luovuttajalle että vastaanottajalle sukulaisluovuttajilla. Informatiivisten STR-loosien määrä voi kuitenkin rajoittua vain kolmeen sukulaisluovuttajan siirtopareissa. Kvantitatiivisten arvojen, jotka edustavat vain kolmen STR-loosin keskiarvoa, on todettu olevan toistettavissa.
- Pahanlaatuisia sairauksia sairastavilla potilailla voi olla kloonimutaatioita, jotka vaikuttavat tiettyihin STR-looseihin. Potilaan alleeli voi puuttua yhdestä tai useammasta STR-loosista, kun verrataan potilaan ennen elinsiirtoa otetusta näytteestä tunnistettuja alleeleja elinsiirron jälkeiseen näytteeseen. Harvinaisissa tapauksissa voidaan havaita ylimääräinen potilaan STR-alleeli tietyssä lokuksessa, jota ei ollut ennen siirtoa otetussa näytteessä. Useimmissa tapauksissa nämä poikkeavuudet johtuvat todennäköisesti kromosomitranslokaatioista. Puuttuvat alleelit voivat johtua myös mutaatiosta STR-konservoituneissa rinnakkaisjaksoissa, joissa PCR-alukkeet sijaitsevat. Puuttuvia tai ylimääräisiä alleeleja sisältävien STR-loosien tietoja ei käytetä kvantifioinnissa.
- Jos potilaan siirtoa edeltäviä soluja ei ole saatavilla, näytteitä, kuten suulakepyyhkäisynäytteitä, ihobiopsioita tai hiusjuuria, voidaan kerätä siirron jälkeen. On kuitenkin huomattava, että buccal-näytteet voivat sisältää merkittäviä määriä luovuttajan soluja.
- Määritystä ei ole tarkoitettu minimaalisen jäännöstaudin havaitsemiseen.
Kliiniset indikaatiot kimerismitestaukselle hematopoieettisissa solusiirroissa
Rutiiniluonteinen elinsiirron jälkeinen dokumentointi, jolla dokumentoidaan luovuttajan/vastaanottajan alkuperää valkosoluissa perifeerisessä veressä ja/tai luuytimessä. Siirron dokumentointiin voi kuulua linjaspesifisten solujoukkojen, kuten CD3-positiivisten T-solujen ja CD33-positiivisten myelooisten solujen, testaaminen.
Luovuttajan/vastaanottajan solujen arviointi potilailla, joilla on riittämätön luuytimen toiminta.
Määritä, onko uusiutuva tai uusi pahanlaatuinen sairaus peräisin vastaanottajan vai luovuttajan soluista.
Arvioi hyljinnän ja uusiutuvan pahanlaatuisen sairauden prognostiset riskit.
Dokumentoi luovuttajan solujen pysyvyys siirron jälkeen potilailla, joilla on uusiutuva sairaus tai jotka ovat sairastuneet ennen luovuttajan lymfosyytti-infuusiota (DLI).
Arvioi, onko siirteen hyljintää esiintynyt vastaanottajilla, jotka ovat ehdolla toiseen elinsiirtoon.
Erittele luovuttajasolujen alkuperä vastaanottajilla, jotka ovat saaneet toisen elinsiirron eri luovuttajan kanssa tai elinsiirron, jossa on käytetty kaksinkertaisia napanuoraveriyksiköitä.
Havaita äidistä peräisin olevien solujen esiintyminen potilailla, joilla on diagnosoitu vaikea yhdistetty immuunipuutos (SCID).
Varmista oletettujen identtisten kaksosten geneettinen identiteetti.
Tiheästi kysyttyjä kysymyksiä
Kysymys:
Vastaus: Miten useita luovuttajia analysoidaan?
Kysymys:
Vastaus: Miksi äidin verensiirto testataan?
Vastaus: Miksi äidin verensiirto testataan? Potilaat, joilla on diagnosoitu vaikea yhdistetty immuunipuutos (SCID), ovat saattaneet saada äidin alkuperää olevia hematopoieettisia soluja kohdussaan. Tietyt linjaspesifiset solujen osajoukot (erityisesti CD3-positiiviset solut) voivat olla pääasiassa tai kokonaan äidin alkuperää.
Kysymys:
Vastaus: Mitä eroa on ”täydellä” ja ”sekamuotoisella” kimerismillä?
Vastaus: Mitä eroa on ”täydellä” ja ”sekamuotoisella” kimerismillä?
”Täydellisellä” kimerismillä tarkoitetaan potilasta, jonka verensiirron jälkeinen hematopoieettisten solujen fenotyyppi on kokonaan luovuttajaperäistä.
”Sekamuotoisella” kimerismillä tarkoitetaan potilasta, jonka verensiirron jälkeinen hematopoieettisten solujen fenotyyppi on sekoitus potilaan ja luovuttajan fenotyyppejä.
Kysymys:
Vastaus: Mitä tapahtuu, jos vastaanottajan perusnäytettä ei ole saatavilla?
Vastaus: Vastaus: Vastaanottajan perusnäytteen saamiseksi elinsiirron jälkeen on useita vaihtoehtoja: vastaanottajan perusnäytteeksi voidaan käyttää poskipyyhe-, hiusjuuri- tai ihobiopsianäytteitä. Suuontelonäytteitä on käytettävä varoen, sillä suuontelonäytteissä voi olla huomattavia määriä luovuttajan soluja.
Kysymys:
Vastaus: Mitä tapahtuu, jos luovuttajan perusnäytettä ei ole saatavilla?
Vastaus: Jos luovuttaja on elossa, otetaan uusi verinäyte. Jos luovuttaja ei ole elossa, elinsiirron jälkeisiä näytteitä on verrattava potilaan elinsiirtoa edeltävään lähtötasoon sellaisten STR-alleelien tunnistamiseksi, joita on havaittu, mutta jotka eivät ole peräisin potilaasta.
Kysymys:
Vastaus: Miksi HLA ei ole käyttökelpoinen keino verensiirron seurantaan? Elinsiirron luovuttajat valitaan siten, että ne sopivat mahdollisimman hyvin yhteen vastaanottajan kanssa. Vastaanottajan ja luovuttajan välillä ei ole HLA-markkereita, jotka erottaisivat toisistaan, jos ne sopivat yhteen, ja vain yksi tai kaksi, jos ne eivät sovi yhteen. Lisäksi muut tekniikat ovat usein herkempiä tähän tarkoitukseen kuin HLA:n yhteensopimattomien alleelien seuranta; näin ollen käytetään muita lokuksia yksilöllisten profiilien tuottamiseksi.
Kysymys:
Vastaus: Mikä on informatiivinen STR-lokus?
Vastaus: Mikä on informatiivinen STR-lokus? Tämä on lokus, jossa on vähintään yksi alleeli, joka on yksilöllinen vastaanottajalle tai luovuttajalle. Jotta lokus olisi käyttökelpoinen kimerismilaskelmissa, siinä on oltava molemmille yksilöllisiä alleeleja. Informatiivisia lokuksia voi olla suuri määrä, jos elinsiirtoon käytetään sukulaista luovuttajaa, mutta hyvin vähän, jos käytetään sopivaa sisarusta. Koska kunkin lokuksen alleelien amplifikaatiotehokkuudessa on eroja, tarkkuuden parantamiseksi on parempi saada keskiarvot tai mediaaniarvot useista lokuksista. Yksittäisten lokusten tulokset ovat luotettavasti toistettavissa, joten jopa yhtä lokusta voidaan käyttää peräkkäisten näytteiden suuntaamiseen.
Kysymys: Mikä on ”amelogeniini”-lokus, joka sisältyy joihinkin amplifiointipaneeleihin?
Vastaus: Amelogeniinigeeni sijaitsee X- ja Y-kromosomeissa. Se ei ole STR, vaan siinä näkyy erikokoisia tuotteita kyseisissä kromosomeissa. Tämä tekee siitä hyödyllisen sukupuolen määrittämisessä. Se sisältyy alukepaneeliin kaupallisissa sarjoissa, jotka on suunnattu rikostekniselle yhteisölle, jossa X/Y-erottelua käytetään laajalti. Sitä ei yleensä käytetä kimeerismianalyysiin, koska se ei voi tarjota ainutlaatuista naismerkkiä (miesnäyte sisältää aina X-alleelin); siitä ei myöskään ole hyötyä arvioitaessa näytteitä sukupuolelle sopivan kantasolusiirron jälkeen.
Kysymys:
Vastaus: Miten STR-kimerismianalyysi eroaa genotyypityksestä? ”Genotyyppi” viittaa tiettyihin alleeleihin, joita esiintyy tietyssä lokuksessa. Genotyypitys tehdään vastaanottaja- ja luovuttajaprofiilien määrittämiseksi kimerismitestauksessa. Kun kimerismianalyysi tehdään kantasolusiirron jälkeen, vastaanottajan ja luovuttajan genotyyppisiä profiileja verrataan siirron jälkeiseen näyteprofiiliin sen arvioimiseksi, kuinka paljon kutakin komponenttia on läsnä.
Genotyypitystä käytetään myös muissa tilanteissa, kuten oikeuslääketieteellisessä tutkimuksessa ja polveutumistestauksessa. Rikostekniset analyytikot käyttävät genotyyppejä todisteiden lähteen tunnistamiseen rikostapauksissa ja henkilöiden sulkemiseen pois epäiltyjen joukosta. He voivat myös tunnistaa ihmisjäännöksiä tuntemattomien henkilöiden tapauksissa ja joukkokatastrofeissa. Vastaavalla tavalla tehdään vanhemmuusmäärityksiä, joilla suljetaan pois joku mahdollinen vanhempi löytämällä lapsessa esiintyviä alleeleja, jotka eivät sovi äidille tai oletetulle isälle.
Literature Cited/Recommended Reading
Bryant E, Martin PJ. Geenisiirron dokumentointi ja kimerismin karakterisointi hematopoieettisten solujen siirron jälkeen. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoieettisten solujen siirto. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.