Kloridi-ionikanavat ja -kuljettajat: luonnon kuriositeeteista ja ihmisen sairauksien lähteistä lääkekohteisiin

Tämä tyydyttää käytännössä kaikki tapaukset luokkahuoneesta tutkimuslaboratorioon, kunnes tarkastelemme kloridikanavia. Tiedämme, että niitä on olemassa, että ne ovat tärkeitä ja että niistä voisi tulla hyviä lääkekohteita useilla tautialueilla, mutta viime aikoihin asti ne ovat pysyneet terapiamaailmassa jokseenkin leimautuneina ja epämuodikkaina. Selektiivisten ligandien puute ei ole auttanut asiaa lainkaan. Ainoa poikkeus tähän on ollut GABA-A-reseptori, joka on kytketty luontaiseen kloridikanavaan, joka avautuu estävän välittäjäaineen GABA:n sitoutuessa. Bentsodiatsepiinit ovat voimistaneet tätä reseptoria siitä lähtien, kun Valium tuli saataville 1960-luvulla, ja niillä on ollut rauhoittavia ja kouristuksia ehkäiseviä vaikutuksia. Tässä esitellään tärkeä käsite: on olemassa useita geeniperheitä ja erilaisia proteiinityyppejä, joita voidaan kuvata kloridikanaviksi.

Tämä eroaa siitä, mitä ymmärrämme kationiselektiivisistä ionikanavista, joissa proteiinirakenteessa on vain vähän joustavuutta, joka voi muodostaa kaliumille, natriumille tai kalsiumille selektiivisen huokosen; näiden ionikanavien moninaisuus johtuu huokosesta erillisten proteiinien domeenien variaatioista, jotka vaikuttavat avautumis- ja sulkeutumiskäyttäytymiseen. Oikeudenmukaisesti sanottuna ei näytä olevan monia fysiologisia syitä sille, miksi anionikanavan pitäisi olla kloridiselektiivinen, koska muiden halogenidien tai pienten anionien kalvokuljetuksella ei ole juurikaan fysiologista merkitystä; mikä tahansa anionikanava on oletusarvoisesti kloridikanava fysiologisesta näkökulmasta. Toisaalta kalium-, natrium- ja kalsiumkalvovirroilla on kullakin erilaiset perustavanlaatuiset roolit, ja kalvon selektiivinen läpäisevyys näille kationeille on ratkaisevan tärkeää solujen toiminnalle ja itse elämälle.

GABA-A-reseptorit kuuluvat cys-silmukan pentameerisiin ligandi-ohjatuihin ionikanavaperheisiin, joihin kuuluu useita erityyppisiä eksitatorisia ja inhiboivia hermovälittäjäaineohjattuja kanavia. CFTR-proteiini (cystic fibrosis transmembrane regulator) on nukleotidisäädelty kloridikanava. Se kuuluu monimuotoiseen ATP-sitovan kasetin (ABC) kuljettajien perheeseen, ja se on ainoa, joka ei näytä kuljettavan mitään substraattia kalvon läpi, vaan toimii pikemminkin kloridikanavana. CLC-perheen jänniteohjatut kloridikanavat ovat peräisin toisesta erillisestä geeniperheestä, ja niiden yleinen rakenne on ainutlaatuinen kalvoproteiinien joukossa. Tämä proteiiniperhe on aiheuttanut monia yllätyksiä viimeisten 30 vuoden aikana, ja tässä esitellään tämän perheen jäseniä ja myös sitä, miten niitä voitaisiin pitää lääkekohteina.

Muutakin jännittävää kehitystä kloridikanavien alalta on tullut sen jälkeen, kun kalsiumaktivoitujen kloridikanavien (ClCa) taustalla olevat proteiinit on tunnistettu molekyylitasolla. Toiminnallisesti olemme tienneet niiden fysiologisista tehtävistä jo jonkin aikaa, mutta kanavaproteiinien viimeaikainen molekulaarinen tunnistaminen on mahdollistanut molekulaaristen ja farmakologisten välineiden kehittämisen niiden aktiivisuuden tutkimiseksi ja muuttamiseksi. Tässä katsauksessa keskitytään ClCa-kanaviin ja CLC-proteiineihin kohdistamisen farmakologisiin mahdollisuuksiin; niiden toiminta ja subcellulaarinen lokalisaatio on esitetty tiivistetysti kuvassa 1.

Esittely CLC-proteiineihin

Kuvan 1

Esittely CLC-proteiineihin

Tämän proteiiniperheeseen kuuluvat yhdeksän jäsentä ovat CLC:stä CLC:stä 1-7:ään, CLC-KA:sta ja KB:sta. Perustajajäsen, CLC-1, on luurankolihaksen jänniteohjattu kloridikanava, ja sitä käsitellään jäljempänä. Monia toiminnallisia tutkimuksia on tehty homologilla, jonka kunniatitteli on CLC-0. Se on eristetty Electroplax-sähköelimestä, jonka avulla rausku pystyy tainnuttamaan vesiuhrejaan. CLC-0:n rekonstruointi lipidikaksoiskerroksiin ja yksittäisten ionikanavien kautta kulkevien virtojen elektrofysiologinen rekisteröinti paljastivat kiehtovan ominaisuuden. Tavallisesti, kun rekisteröidään virtaa pienestä kalvopalasta, joka sisältää yhden ionikanavan, havaitaan vaihtelua kahden virta-amplitudin välillä: toinen edustaa suljettua kanavaa ja toinen avoimen kanavan läpi kulkevaa virtaa. Vaihtelut heijastavat siirtymiä avoimen ja suljetun kineettisen tilan välillä. CLC-0:n kohdalla oli kuitenkin ilmeistä, että yksittäinen ionikanavaproteiini koostui kahdesta vastaavasta huokosesta, jotka saattoivat avautua toisistaan riippumatta1. Siksi tätä kanavaa kuvattiin kaksoispiippuiseksi (kuva 2). Näin ollen ei ollut suuri yllätys, että enterobakteereista peräisin olevien homologien kiderakenteet paljastivat, että proteiinikompleksi oli dimeeri, jossa kummallakin alayksiköllä oli oma ionijohtoreitti2 (kuva 2).

Toinen yllätys syntyi, kun E. colista peräisin olevalla CLC-ec1:llä tehtiin yksityiskohtaisia funktionaalisia kokeita. Sen sijaan, että CLC-ec1 toimisi kloridikanavana, kuten sen kauan kadoksissa ollut sukulainen selkärankaisten luurankolihaksessa, CLC-ec1 on 2Cl-/H+ -vaihtotransportteri eli antiportteri, jolla on tiukka 2:1-vaihtostoikiometria3. Tämä proteiini on tärkeä suolistobakteerien selviytymiselle alhaisessa pH:ssa4 , ja se todennäköisesti hyödyntää kloridigradienttia pitääkseen solujen pH:n siedettävällä tasolla. Prokaryoottiset CLC:t saattavat sen vuoksi olla patogeenisen E. coli- tai Salmonella-infektion hoidossa käytettävien inhibiittorien kohteita4. Ioninvaihtokäyttäytymisen löytyminen herätti luonnollisesti lisäponnisteluja sen selvittämiseksi, esiintyykö nisäkkäiden CLC-kanavissa tällaista kloridien ja protonien välistä vaihtoa, olettaen, että Cl-/H+ -vaihto saattaa olla arkkityyppisten CLC-kanavien todellinen tehtävä ja että kloridikanaviksi tunnistetut kanavat saattavat olla vain poikkeuksia sääntöön. Näin näyttää olevan, sillä on vahvaa näyttöä siitä, että CLC-3:sta CLC-7:ään toimivat 2Cl-/H+ -vaihdon kuljettajina, jotka sijaitsevat pääasiassa solunsisäisissä organelleissa, kun taas CLC-1, CLC-2, KA ja KB ovat todellisia plasmakalvon kloridia johtavia ionikanavia5-9. Koska CLC:n arkkityyppinen ominaisuus on vaihtokuljetus, jota esiintyy kaikissa soluelämän muodoissa, proteiinien jälkimmäistä alaluokkaa, aitoja kloridikanavia, voidaan näin ollen pitää ”rikkinäisinä” kloridikuljettajina, jotka ovat menettäneet kloridikuljetuksen kytkennän toisen substraatti-ionin siirtoon.

CLC-1

Tämä CLC-perheen perustaja on luurankolihaksen jänniteohjattu kloridikanava, ja sen tehtävänä on säädellä kalvopotentiaalia ja repolarisoida kalvo toimintapotentiaalien jälkeen lihaksen rentouttamiseksi. Useimmissa kudoksissa olettaisimme kaliumkanavien toimivan tässä roolissa, mitä ne tekevät sydän- ja sileässä lihaksessa sekä säätelevät kalvojen herätettävyyttä muissa solutyypeissä. Poikittainen putkijärjestelmä on plasmakalvon (sarkolemman) jatke ja tunkeutuu supistuvaan kudokseen. Se on ratkaisevan tärkeä sähköisen aktiivisuuden nopealle leviämiselle koko lihakseen ja organisoi nopeaa ja hallittua supistumista. Kaliumin poistuminen lihassoluista t-tubuluksen suljettuun tilaan nostaisi solunulkoista kaliumpitoisuutta ja romahduttaisi tämän ionigradientin, mikä johtaisi pitkittyneeseen kalvon depolarisaatioon. Kun kloridikanavilla on hallitseva repolarisoiva rooli, tämä estyy. CLC-1:n toiminnan menetysmutaatiot johtavat myotoniaan ihmisillä, vuohilla ja hiirillä (ks. tuore katsaus10), ja sille on ominaista heikentynyt lihasrelaksaatio, joka on yhdenmukainen repolarisoivan kalvovirran menettämisen kanssa.

Koska CLC-1:n ilmentyminen rajoittuu luustolihaksiin, se saattaa olla houkutteleva kohde lääkkeille, jotka kontrolloivat lihaksen supistumista kasvattamalla tai vähentämällä CLC-1:n toimintaa ja vähentämällä tai kasvattamalla siten lihaksen eksitoituvuutta. Yhdisteet, jotka lisäävät CLC-1:n toimintaa, saattaisivat pystyä hoitamaan myotoniaa, erityisesti tapauksissa, joissa ne voisivat kompensoida kloridikanavien aktiivisuuden osittaista menetystä. CLC-1:n estäminen voisi alentaa lihassupistuksen kynnystä, ja siitä voisi olla hyötyä lihasheikkoudessa tai degeneratiivisissa sairauksissa, kuten lihasdystrofiassa.

CLC-2

Sisäänpäin oikaisevalla kloridikanavalla, CLC-2:lla, on jokseenkin laaja kudosjakauma. Sitä esiintyy keskushermostossa, jossa se säätelee hermosolujen toimintaa11-13. Astrosyyteissä sen subcellulaarista kohdentumista soluliitoksiin säätelee vuorovaikutus GlialCAM:n (MLC1) kanssa, jonka mutaatiot häiritsevät tätä kohdentumista ja aiheuttavat megalensefaalista leukoenkefalopatiaa14. Viimeaikaiset terapeuttiset kiinnostuksen kohteet liittyvät CLC-2:n ilmentymiseen suolen limakalvolla ja keuhkopronchioleissa, joissa sillä on merkitystä suoliston ja keuhkojen erityksessä. Kliinisesti ummetusta lievittävän lääkkeen lubiprostonin on ehdotettu vaikuttavan aktivoimalla CLC-2:ta, mutta tämä vaikutus on kiistanalainen. Joissakin tutkimuksissa tämä yhdiste aktivoi CLC-2-kanavia, mutta toisissa tutkimuksissa se säätelee CLC-2:n kulkeutumista ja lisää CFTR:n toimintaa prostaglandiinireseptorin aktivoitumisen kautta15,16. On kuitenkin edelleen riittävästi näyttöä siitä, että hengitysteiden CLC-2:n toiminnan lisääminen voisi tarjota vaihtoehtoisen kloridireitin kystisessä fibroosissa17.

CLC-KA/KB

Nämä kloridikanavat ilmentyvät erityisesti munuaisten epiteeleissä, ja ne myötävaikuttavat solukalvojen läpäisevyyteen passiiviselle kloridivirralle. Niillä on keskeinen rooli nefronin nousevassa raajassa ja distaalisissa tubuluksissa, sillä ne tarjoavat basolateraalisen reitin kloridin takaisinimeytymiselle sen jälkeen, kun kloridi on kulkeutunut ensisijaisesta virtsasta apikaalisen kalvon kautta. CLCKB-geeni, joka koodaa CLC-KB:tä, on yksi viidestä geenistä, jotka ovat Bartterin oireyhtymän taustalla. CLC-KB:n toimintakyvyttömyysmutaatiot johtavat puutteelliseen kloridin takaisinimeytymiseen ja siten suolaa tuhlaavaan häiriöön, johon liittyy polyuria. Yksi CLC-KB-mutaatioista kärsivien henkilöiden (Bartterin tyyppi III) pääpiirteistä on alhainen verenpaine. Vaikeamman tautimuodon aiheuttavat mutaatiot BSND-geenissä (Bartterin tyyppi IV), joka koodaa Barttinia, apuproteiinia, joka on tärkeä sekä CLC-KA:n että KB:n kulkeutumisessa plasmakalvoon18. Tähän sairauden muotoon kuuluu myös sensorinen kuurous, jonka ajatellaan johtuvan siitä, että sekä CLC-KA:n että KB:n kulkeutuminen sisäkorvan epiteelikalvoille estyy. Oletettavasti kuulojärjestelmä voi sietää joko CLC-KA:n tai KB:n aktiivisuuden menetystä, mutta ei molempia. Tämä viittaa siihen, että joko CLC-KA:n tai CLC-KB:n selektiiviset inhibiittorit tai molempien osittainen inhibitio voivat toimia uutena loop-diureettina, jolla on mahdollisuus alentaa verenpainetta ja jolla on vain vähän sivuvaikutuksia. Tämä on johtanut niiden farmakologian tutkimiseen ja sellaisten uusien inhibiittorijohdannaisten kehittämiseen, joilla on alhainen mikromolaarinen affiniteetti19 ja joilla oli diureettisia vaikutuksia, kun niitä annettiin rotille20. Toisaalta lääkkeet, jotka aktivoivat CLC-KB-kanavia, voivat lisätä viallisten kanavien jäännösaktiivisuutta Bartterin tyypin III potilailla.

CLC-7

2Cl-/H+ -vaihtokuljettimen alaluokasta CLC-7 on lupaava lääkkeiden vaikutuskohde, ja sen estämisestä voi olla hyötyä osteoporoosissa. Tämäkin indikaatio juontaa juurensa havainnoista, jotka koskevat CLC-7:n toimintakyvyttömien mutaatioiden aiheuttamaa ihmissairautta, joka aiheuttaa osteropetroosia21. Tässä sairaudessa osteoklastien suorittama luun uudelleenmuokkaus on puutteellista, minkä uskotaan johtuvan happojen ja entsyymien puutteellisesta erityksestä. Tämä johtaa tiheään luustoon, joka CLC-7:n estäjän avulla voitaisiin palauttaa, mikä voisi vähentää luun hajoamista ja siten vahvistaa osteoporoosipotilaiden luustoa22,23. Proof-of-concept -tutkimuksissa farmakologinen happamoitumisen estäminen24 tai CLC-7:n toiminnan häiritseminen vasta-aineilla25 vähensi luun resorptiota. CLC-7:n estäminen ei kuitenkaan välttämättä ole ongelmatonta, sillä ihmisillä ja hiirillä tehdyt tutkimukset viittaavat siihen, että CLC-7:n toiminnan puute voi liittyä myös hermosolujen varastointi- ja rappeutumishäiriöihin heikentyneen lysosomaalisen toiminnan vuoksi26.

Loss-of-function human mutations – lessons from CFTR

Tässä vaiheessa on syytä pysähtyä hetkeksi miettimään, että joillakin uusien CLC:hen kohdistuvien lääkkeiden terapeuttisilla käyttöaiheilla pyritään hoitamaan häiriöitä, jotka ovat erilaisia ja vastakkaisessa ääripäässä kuin ne, jotka johtuvat CLC:n puutteellisesta toiminnasta. Edellä kuvattujen lisäksi Dentin I-tauti on X-sidonnainen munuaissairaus, joka johtuu CLC-5:n toiminnan heikkenemisestä (ks. tuore katsaus27 ). Kaikki ovat harvinaisia perinnöllisiä sairauksia, ja tärkeimpänä proteiinivirheenä on joko proteiinin vähentynyt aktiivisuus tai kulkeutuminen kohdekalvolle. Itse asiassa monet yksittäiset mutaatiot aiheuttavat ER-pidätystä ja proteiinin kypsymisen puutetta. Rinnastus voidaan tehdä kystiseen fibroosiin, jossa suurimmalla osalla sairastuneista henkilöistä on ER-retentio ΔF508-mutaatio. Viimeaikaiset ja eriytetyt lähestymistavat kystisen fibroosin hoitoon ovat olleet tulosta kaksitahoisesta hyökkäyksestä, jossa on pyritty korjaamaan mutaatioproteiinin taittumista (CF-korjaimet) ja/tai lisäämään plasmakalvon CFTR-kloridikanavien aktiivisuutta (CF-potentiaattorit). Potentiaattoriluokka on osoittautumassa menestyksekkääksi28 , sillä ne ovat tehokkaita potilailla, joilla on mutaatioita, jotka vähentävät CFTR:n aktiivisuutta menettämättä proteiinin biosynteesiä tai kulkeutumista (esim. G551D), mutta taittumisen korjaajien (joita tarvitaan useimmissa tapauksissa) tehokkuus on vielä vahvistamatta29. Vaikka kaikki CLC:n toiminnan menetykseen liittyvät sairaudet ovat harvinaisia geneettisiä häiriöitä, voimme ehkä jonain päivänä hoitaa myotoniaa, Bartterin oireyhtymää, Dentin tautia ja osteopetroosia sekä kystistä fibroosia sairastavia henkilöitä lääkkeillä, jotka korjaavat heidän häiriönsä todellisen syyn.

Kalsiumaktivoidut kloridikanavat

Lopuksi mainitaan kalsiumaktivoidut kloridikanavat (ClCa-kanavat), joilla on selkeästi määritelty fysiologinen rooli useissa solutyypeissä, mutta niiden molekyylitunnistus on kuitenkin kärsinyt muutamasta väärästä ja änkytyksestä. Tarinaan liittyy neljä proteiinityyppiä: CLCA-, Bestrophin-, Tweety- ja TMEM16-geeniperheiden jäsenet. Kaikissa tapauksissa niiden rekombinanttinen yliekspressio johti kalvojen kloridivirtojen syntyyn, joita stimuloidaan nostamalla solunsisäistä kalsiumpitoisuutta ja vaihtelevassa määrin kalvojen depolarisaatiolla. CLCA:n matka päättyi, kun havaittiin, että kyseessä on proteiini, joka erittyy, mutta todennäköisesti myös säätelee ekspressiojärjestelmässä endogeenisten ClCa-kanavien kalvoekspressiota30. Tweety- ja bestrofiiniproteiineilla ei ole kaikkia tärkeimmissä kudoksissa tutkittujen ClCa-kanavien ominaisuuksia, vaikka Best1 näyttääkin olevan vastuussa eräästä ClCa-kanavan osasta aistineuronien hermosoluissa31 , ja se voi myös olla tärkeä endoplasmisesta retikulumista vapautuvan kalsiumin säätelijä32,33. Kolmessa riippumattomassa tutkimuksessa ehdotettiin TMEM16A:ta (jota kutsutaan myös Ano1:ksi) ehdokkaaksi kalsiumin aktivoiman kloridikanavan pääkomponentiksi, joskaan ei kokonaisuudessaan34-36. Monet myöhemmät tutkimukset, joita molekulaaristen työkalujen luominen on helpottanut, ovat tukeneet tätä. TMEM16A on tärkeä kalvojen herätettävyyden säätelyssä verisuonten sileässä lihaksessa, se on säännelty ylöspäin keuhkoverenpainetaudin eläinmallissa, ja tonusta voidaan vähentää kanavan estolla37,38. Sensorisissa hermosoluissa TMEM16A kytkee tulehdusvälittäjäaineiden läsnäolon kalvojen yliherkistyvyyteen, ja TMEM16A:n estolla on antinociceptivisia vaikutuksia39. Astman eläinmalleissa tämän kloridikanavan ilmentyminen on lisääntynyt, ja sen estolla voi olla suotuisia vaikutuksia40. Sitä esiintyy myös suolen Cajalin interstitiaalisissa soluissa, ja kanavan toimintaa tarvitaan suolen seinämän sileän lihaksen rytmiselle supistumiselle41. Lisäksi TMEM16A:n aktivaatio voi tarjota vaihtoehtoisen reitin epiteelin kloridin eritykselle kystisessä fibroosissa42. Muiden TMEM16-perheen jäsenten tarkasta toiminnasta käydään edelleen keskustelua, mutta ClCa-toiminta on liitetty myös TMEM16B:hen (Ano2), jonka uskotaan olevan hajukarvasolujen ClCa-kanavan taustalla43,44. Tällä ionikanavien luokalla voi olla rooleja myös syöpäsolujen biologiassa, ja sen estäminen voi estää solujen lisääntymistä45-48.

Loppuhuomautukset

Tässä katsauksessa on tuotu esiin kloridia johtavien tai kuljettavien proteiinien moninaisia rooleja ja sitä, miten niiden toimintahäiriöt liittyvät ihmisen häiriöihin tai sairauden kaltaisiin oireisiin eläinmalleissa. Farmakologisista reagensseista, jotka estävät, aktivoivat tai parantavat kloridikanavien ja -kuljettajien kalvoliikennettä, on vakava puute. CFTR:n virheellistä toimintaa kystisessä fibroosissa kumoavien lääkkeiden kehityksessä on edistytty, mikä toivottavasti johtaa lääkkeisiin, jotka ovat spesifisiä erityyppisille perinnöllisille mutaatioille. TMEM16A-kalsiumaktivoitujen kloridikanavien42,49 estäjät ja aktivaattorit ovat osoittautuneet hyödyllisiksi laboratoriovälineiksi, ja uusista yhdisteistä voi tulla tehokkaita lääkkeitä, etenkin jos niillä voidaan saavuttaa kudosspesifisiä vaikutuksia. Tiettyihin CLC-kanaviin spesifiset molekyylit ovat luultavasti kaikkein vaikeimmin löydettävissä. Jänniteohjattujen CLC-kanavien aktivoitumisen rakenteellisen perustan ymmärtäminen50 saattaa tunnistaa proteiinialueita, joihin voidaan kohdistaa rationaalinen rakennepohjainen lääkesuunnittelu. Tällaisten välineiden avulla voimme testata joitakin tässä tarkasteltuja ja esiteltyjä uusia terapeuttisia ideoita.

Autorin elämäkerta

Dr Jon Lippiat väitteli tohtoriksi kaliumkanavien rakenteesta, toiminnasta ja farmakologiasta Leicesterin yliopistossa. Hän tutki haiman beetasolujen toimintaa ja diabetesta Oxfordin yliopistossa ennen nimitystään farmakologian lehtoriksi Leedsin yliopistoon. Hänen tutkimuksensa käsittää useiden erityyppisten ionikanavien ja -kuljettajien rakenteellisten ja fysiologisten ominaisuuksien selvittämisen ja niiden mahdollisen kohdentamisen uusilla farmakologisilla reagensseilla.