Koliinin puute heikentää painonnousua ja parantaa glukoosinsietokykyä ob/ob-hiirillä

Abstract

Varhaisemmat tutkimukset osoittivat, että koliinin tarjonta liittyy suoraan rasvaisen ruokavalion aiheuttamaan lihavuuteen ja insuliiniresistenssiin hiirillä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, voisiko koliinin saanti moduloida myös geenivirheen aiheuttamaa lihavuutta ja insuliiniresistenssiä. Kahdeksan viikon ikäisiä ob/ob-uroshiiriä ruokittiin kahden kuukauden ajan joko koliinipuutteisella tai koliinilla täydennetyllä ruokavaliolla. Kudospaino, mukaan lukien rasvamassa ja vähärasvainen massa, arvioitiin. Lisäksi tutkittiin solunsisäistä signalointia, plasman glukagonia ja insuliinia sekä glukoosin ja insuliinin sietokykyä. Koliinipuutosruokavalio hidasti kehon painonnousua ja vähensi rasvamassaa. Koliinin puute alensi myös plasman glukoosipitoisuutta ja paransi glukoosin ja insuliinin sietokykyä, vaikka rasvamaksa paheni. Koliinipuutosruokavaliolla havaittiin myös lisääntynyttä rasvan lipolyysiaktiivisuutta, vähentynyttä plasman glukagonin määrää ja vähentynyttä maksan glukagonireseptorin ilmentymistä. Tuloksemme osoittavat, että koliinipuutteinen ruokavalio voi vähentää rasvamassaa ja parantaa glukoosinsietokykyä geneettisen vian aiheuttamissa lihavissa ja diabeettisissa hiirissä.

1. Johdanto

Koliini on tärkeä ravintotekijä, joka osallistuu joihinkin keskeisiin prosesseihin, kuten välittäjäaineen asetyylikoliinin ja tärkeimmän kalvokomponentin fosfatidyylikoliinin (PC) biosynteesiin . PC voidaan syntetisoida joko CDP-koliinireitin kautta tai fosfatidyylietanoliamiinin metyloimalla fosfatidyylietanoliamiinin N-metyylitransferaasin (PEMT) avulla. PEMT-reitti on määrällisesti merkittävä vain maksassa . Koliini on myös välttämätön välittäjäaineen asetyylikoliinin esiaste, joka vaikuttaa muskariini- ja nikotiinisten asetyylikoliinireseptorien kautta. Viime vuosina on ilmennyt mahdollinen yhteys koliinin ja lihavuuden/diabeteksen välillä . On ehdotettu, että muskariiniset asetyylikoliinireseptorit voisivat olla lihavuuden terapeuttinen kohde . Hiljattain havaitsimme, että PEMT-puutos voisi suojata hiiriä rasvaisen ruokavalion aiheuttamalta lihavuudelta ja insuliiniresistenssiltä. Tämä suoja kuitenkin hävisi, kun runsasrasvaiseen ruokavalioon lisättiin suuri annos koliinia . PEMT-reitti, jota seuraa PC-katabolia, on ainoa tunnettu koliinin biosynteesireitti nisäkkäillä . PEMT-puutteisilla hiirillä havaittiin merkittävä koliinipitoisuuden väheneminen useissa kudoksissa (Li ym., julkaisemattomat tiedot), mikä tarjoaa suoran yhteyden koliinin ja runsaasti rasvaa sisältävän ruokavalion aiheuttaman lihavuuden/insuliiniresistenssin välille. Tässä tutkimuksessa syötimme ob/ob-hiirille koliininpuutteista (CD) ruokavaliota arvioidaksemme, voisiko koliinin puute myös moduloida geneettisesti johtuvaa lihavuutta ja insuliiniresistenssiä.

2. Aineisto ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät. Eläimet ja ruokavalio

Kaikki toimenpiteet hyväksyttiin Albertan yliopiston institutionaalisessa eläintenhoitokomiteassa Kanadan eläintenhoitoneuvoston ohjeiden mukaisesti. Jackson Laboratorion 8-viikkoiset urospuoliset ob/ob-hiiret akklimatisoitiin 1 viikon ajan. Kussakin ryhmässä käytettiin 5 hiirtä. Hiiret saivat vapaasti käyttää koliinipuutteista (CD) tai koliinilla täydennettyä (CS) ruokavaliota 2 kuukauden ajan. CD-ruokavalio (MP Biomedicals Canada, luettelonumero 901387) sisälsi 20 % rasvaa laardina. CS-ruokavalio koostui CD-ruokavaliosta, johon oli lisätty 0,4 % (w/w) koliinikloridia. Hiiret uhrattiin nukuttamalla isofluraanilla, minkä jälkeen sydän punktioitiin.

2.2. Hiiret teurastettiin. Kehon painonnousu, vähärasvaisen massan ja rasvamassan mittaus

Kehon paino mitattiin viikoittain. Vähärasvainen massa ja rasvamassa analysoitiin 2 kuukautta sen jälkeen, kun hiiret oli laitettu ruokavaliolle (premortem), käyttäen EchoMRI-järjestelmää.

2.3. Glukoosin ja insuliinin sietotesti

Glukoosin sietotesti: 12 tunnin paaston jälkeen hiiret saivat vatsakalvon sisäisen injektion (i.p.) 0,5 g dekstroosia/kg ruumiinpainoa, joka oli liuotettu steriloituun fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Insuliinin sietokykytesti: kuuden tunnin paaston jälkeen hiiret saivat i.p.-injektiona 1,0 yksikköä insuliinia (Sigma) / kehon painokilo PBS:ssä. Veren glukoosipitoisuudet mitattiin glukometrillä häntävuodoista ennen injektiota ja ilmoitettuina aikoina injektion jälkeen.

2.4. Mitokondriokompleksi I/II:n aktiivisuuden mittaukset

Mitokondriokompleksi I:n ja II:n aktiivisuus määritettiin käyttämällä mitokondrioproteiinia. Lyhyesti sanottuna mitokondrioproteiinin eristämiseksi näytteet pidettiin jäässä ja homogenisoitiin puskurissa, joka sisälsi 75 mM sakkaroosia, 225 mM sorbitolia, 1 mM EGTA:ta ja 0,1 % rasvahappovapaata naudan seerumin albumiinia 10 mM Tris-HCl:ssä pH 7,4. Homogenoitua ainetta sentrifugoitiin 600 × g:n voimakkuudella 15 minuutin ajan, ja näin saatua supernatanttia sentrifugoitiin edelleen 20 minuutin ajan 16 200 rpm. Pelleteissä oleva mitokondrioproteiini suspendoitiin puskuriin, joka sisälsi 20 mM Tris ja 25 mM sakkaroosia (pH 7,4), ja se säilytettiin -80 °C:ssa käyttöön asti. Aktiivisuus mitattiin spektrofotometrillä 5 minuutin ajan absorbanssin pienenemisenä 600 nm:ssä, joka johtuu 2,6-dikloorifenoli-indofenolin (DCPIP) pelkistymisestä ubikinoni-1:ksi joko NADH:n (kompleksi I:n substraatti) tai sukkinaatin (kompleksi II:n substraatti) läsnä ollessa. Reaktio suoritettiin antimysiinin ja kaliumsyanidin läsnä ollessa kompleksi III:n ja kompleksi IV:n inhibiittoreina. Rotenoni, kompleksi I:n inhibiittorina, oli mukana myös kompleksi II:n aktiivisuuden reaktiopuskurissa.

2.5. Histologia ja immunoblottaus

Histologiaa varten maksat tai rasvapatjat leikattiin 10 % formaldehydiin PBS:ssä, minkä jälkeen tehtiin rutiininomainen hematoksyliini- ja eosiinivärjäys. Immunoblottausta varten maksanäytteiden homogenisoinnin ja 600 × g:n sentrifugoinnin jälkeen tuloksena saadut supernatantit määritettiin proteiinipitoisuuden määrityksessä (BioRad) sen varmistamiseksi, että yhtä suuri määrä proteiineja ladattiin SDS-PAGE:lle. Kaikki primaariset vasta-aineet hormoniherkkää lipaasia (fosfo-HSL/totaalinen HSL), fosfoenolipyruvaattikarboksykinaasia (PEPCK), asetyyli-CoA-karboksylaasia (fosfo-ACC/totaalinen ACC) ja AMP-aktivoitua proteiinikinaasia (fosfo-AMPK/totaalinen AMPK) vastaan on ostettu Cell Signalingilta. Pyruvaattidehydrogenaasikinaasi-isotsyymi 4:n (PDK4) ja glukagonireseptorin vasta-aineet saatiin Abcamilta, mutta sytokiinisignaalien suppressor of cytokine signaling 3:n (SOCS3) ja PGC-1α:n vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnologylta.Tubliinia tai aktiinia käytettiin kuormituskontrolleina normalisointia varten. Kuva analysoitiin ImageJ-ohjelmistolla.

2.6. Plasman insuliinin ja glukagonin mittaus

Mittaukset suoritettiin käyttämällä hiiren/rotan glukagoni-, insuliinimäärityssarjaa (Meso Scale Discovery) yhtiön ohjeiden mukaan.

2.7. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Erot arvioitiin käyttämällä opiskelijan t-testiä. Arvo 𝑃<0.05 katsottiin merkitseväksi.

3. Tulokset

Koliinipuutosruokavalio hidasti merkitsevästi ruumiinpainon nousua 2 kuukauteen asti (kuva 1(a)) vaikuttamatta ruoankulutukseen (päivittäinen ruoankulutus 7,21±1,23 g CD-hiirillä vs. 7,39±1,31 g CS-hiirillä, 𝑃>0.05). Aloituspainossa oli merkittävä ero kahden ryhmän välillä (30,42±1,70 g CD-hiirillä ja 26,3±2,26 g CS-hiirillä, 𝑃=0,01). Koliinin puute ei vaikuttanut sydämen, maksan tai munuaisten painoon (kuva 1(b)), mutta epididymaalisen ja perirenaalisen rasvan paino väheni merkittävästi (kuva 1(c)). Lisäanalyysi, jossa käytettiin magneettikuvausta, osoitti, että koliinin puute vähensi koko kehon rasvamassaa ja lisäsi kuitenkin vähärasvaista massaa riippumatta siitä, ilmaistiinko sitä absoluuttisena massana vai suhteellisena prosenttiosuutena koko kehon massasta (kuva 1(d)). Koliinin puute lisäsi rasvakudoksen fosfohormoniherkän lipaasin, entsyymin aktivoidun muodon, ilmentymistä (kuva 1(e)). Sen sijaan koliinin puute ei muuttanut rasvakudoksen morfologiaa (kuva 1(f)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Koliinin puute vaikutti ruumiinpainoon, minkä lisäksi se alensi myös plasman paastoglukoosipitoisuutta (14,3±1,67 vs. 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) ja glukagonipitoisuutta (kuvio 2(a)), vaikkei se vaikuttanut plasman insuliinipitoisuuteen (kuvio 2(b)). Koliinipuutosruokavaliota saaneilla hiirillä havaittiin merkittävästi parantunut glukoosi- ja insuliiniintoleranssi (kuvat 2(c)-2(d)). Taustamekanismin selvittämiseksi analysoitiin glukoosin hapettumisen kannalta keskeiset entsyymit. Koliinin puute vähensi PDK4:n (kuva 3(a)), pyruvaattidehydrogenaasiaktiivisuuden negatiivisen säätelijän, joka kontrolloi mitokondriaalisen asetyyli-CoA:n sisäänvirtausta, maksan proteiiniekspressiota (kuva 3(a)), mikä viittaa glukoosin tehostuneeseen hyödyntämiseen. Samoin maksan PGC-1α (tunnettu PDK4:n ylävirran modulaattori) ja PEPCK (PGC-1 α:n alavirran kohde ja keskeinen entsyymi glukoneogeneesin kannalta) vähenivät (kuva 3(b)), mikä viittaa vähentyneeseen glukoneogeneesiin. Lisäksi tutkimme, voisiko parantunut glukoosi- ja insuliini-intoleranssi liittyä maksan tulehduksen ja mitokondrioiden toiminnan muutokseen. Se ei vaikuttanut proinflammation merkkiaineena toimivan SOCS3:n (kuva 3(c)) proteiini-ilmentymiseen eikä mitokondriaalisen sitraattisyntaasin aktiivisuuteen (tietoja ei ole esitetty). Koliinin puute vähensi kuitenkin merkittävästi mitokondriokompleksi II:n, mutta ei kompleksi I:n, aktiivisuutta (kuva 3(d)). Mielenkiintoista on, että myös maksan glukagonireseptorin proteiiniekspressio väheni koliinin puutteessa (kuva 3(e)).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Kuvio 2

Choline-puutteellinen ruokavalio parantaa glukoosi- ja insuliini-intoleranssia. 8-viikkoiset urospuoliset ob/ob-hiiret saivat vapaasti käyttää joko CD- tai CS-ruokavaliota 2 kuukauden ajan. Plasman paastoglukagonin (a) ja insuliinin (b) taso mitattiin. Suoritettiin vatsansisäinen glukoosin sietotesti (c) ja insuliinin sietotesti (d). ∗∗𝑃<0,01 ja ∗𝑃<0,05 verrattuna CS-ryhmään.

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Kuva 3

Molekulaariset mekanismit, jotka ovat osallisina insuliiniherkkyyden paranemiseen ob/ob-hiirillä, jotka saavat koliini-puutteellisella ruokavaliolla. 8-viikkoiset urospuoliset ob/ob-hiiret saivat vapaasti käyttää joko CD- tai CS-ruokavaliota 2 kuukauden ajan. PDK4:n (a), PEPCK:n, PGC-1α:n (b), SOCS3:n (c) ja glukagonireseptorin (e) maksan proteiiniekspressio määritettiin immunoblottauksella. Mitokondriokompleksi I:n ja II:n aktiivisuus mitattiin myös (d). ∗𝑃<0.05 verrattuna CS-ryhmään.

Vaikka glukoosinsietokykyä parantaakin, koliinin puute pahentaa rasvamaksaa, mitä tukevat histologinen analyysi ja maksan triglyseridimassan lisääntyminen (kuva 4(a)). Ymmärtääksemme koliinin puutteen aiheuttaman rasvamaksan taustalla olevia mekanismeja tarkastelimme rasvahappojen β-oksidaatioon ja lipogeneesiin osallistuvia entsyymejä. Koliinin puute lisäsi maksan glyseroli-3-fosfoasyyliasyylitransferaasin (GPAT) aktiivisuutta (kuva 4(b)) ja vähensi rasvahappojen β-oksidaation keskeisen entsyymin β-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasin (β-HAD) aktiivisuutta (kuva 4(c)), mikä viittaa siihen, että enemmän solunsisäisiä rasvahappoja kanavoitiin pikemminkin lipidien biosynteesiin kuin hapettamiseen. Tätä käsitystä tuki myös maksan fosfo-AMPK:n ja fosfo-ACC:n ilmentymisen väheneminen (kuva 4(d)), mikä sitten aktivoi ACC:n ja tehostaa maksan lipogeneesiä.

(a)

(b)

(c)

(d)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

4. Keskustelu

Edellisessä työssä olemme osoittaneet, että koliinin lisäys liittyy rasvaisen ruokavalion aiheuttamaan lihavuuteen ja insuliiniresistenssiin PEMT-puutteisilla hiirillä . Äskettäin olemme havainneet, että koliinin aiheuttama insuliiniresistenssi on koliinispesifinen paitsi villityyppisillä hiirillä myös PEMT-puutteisilla hiirillä (Wu ja Vance ym. julkaisemattomat tiedot). Tässä tutkimuksessa selvitimme koliinin puutteen vaikutusta ob/ob-hiiriin. Osoitimme viisi uutta koliinin puutteen vaikutusta: (1) lisääntynyt rasvan lipolyyttinen aktiivisuus; (2) parantunut glukoosin hapettuminen; (3) vähentynyt maksan rasvahappojen hapettuminen; (4) alasreguloitunut maksan glukagonireseptorin ilmentyminen; (5) vähentynyt maksan mitokondriokompleksin II aktiivisuus.

4.1. Koliinin puute heikentää kehon painonnousua

Koliinin puute heikentää merkittävästi Pemt-/-hiirten runsasrasvaisen ruokavalion aiheuttamaa lihavuutta ja ob/ob-hiirten painonnousua. Raubenheimer ym. kuitenkin raportoivat, että koliinin puute ei vaikuttanut painonnousuun tai rasvakudoksen painoon . Ero kahden tutkimuksen välillä voi johtua eläinmallien ja ruokintaprotokollien eroista. Raubenheimerin tutkimuksessa C57Bl/6-hiiriä ruokittiin joko runsasrasvaisella tai vähärasvaisella ruokavaliolla 8 viikon ajan, mutta hiiret saivat CD- tai CS-ruokavaliota vain viimeiset 4 viikkoa. Meidän ob/ob-hiirillemme syötettiin runsasrasvaista CD- tai CS-ruokavaliota 8 viikon ajan. Kirjallisuudessa sekä urospuolisia että naaraspuolisia ob/ob-hiiriä on käytetty laajasti aineenvaihduntatutkimuksissa, kuten kehon painonnousun ja maksan (ja lihasten) insuliiniherkkyyden tutkimisessa, eikä merkittävää sukupuolivaikutusta ole raportoitu. Tutkimuksessamme käytettiin vain urospuolisia ob/ob-hiiriä.

Nykyinen tutkimuksemme osoittaa, että koliini voi myös muokata geneettisesti johtuvaa lihavuutta. Koska koliinin puute ei vaikuttanut ruoankulutukseen, lisääntynyt rasvan lipolyyttinen aktiivisuus (aktiivisen hormoniherkän lipaasin lisääntynyt ilmentyminen) voi selittää pienentyneen rasvamassan ja kehon painonnousun. Lisäksi emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että koliinin puute voisi lisätä energiankulutusta tai UCP1:n ilmentymistä ruskeassa rasvakudoksessa ja UCP2/UCP3:n ilmentymistä luurankolihaksessa, jotka ovat mahdollisia tekijöitä, jotka edistävät painonnousun vähenemistä .

4.2. Koliinin puute parantaa glukoosinsietokykyä

Vastoin kuin koliinin lisäys, joka liittyy runsasrasvaisen ruokavalion aiheuttamaan insuliiniresistenssiin hiirillä , koliinin puute paransi glukoosinsietokykyä ob/ob-hiirillä. Tämä on yhdenmukainen Raubenheimerin tutkimuksen kanssa, jossa C57Bl/6-hiirillä, jotka saivat runsaasti rasvaa sisältävää CD-ruokavaliota, insuliinipitoisuudet laskivat ja glukoosin sietokyky parani verrattuna koliinilla täydennettyyn runsaasti rasvaa sisältävään ruokavalioon . Korkeaa plasman glukagonipitoisuutta esiintyy yleensä tyypin 2 diabeetikoilla . Koliini-injektio nosti sekä plasman insuliini- että glukagonitasoja rotilla . Koliinin puute tutkimuksessamme sitä vastoin vähensi plasman glukagonin määrää ja glukagonireseptorin ilmentymistä. Koska viime vuosina glukagonireseptorin antagonisteja on ehdotettu tyypin 2 diabeteksen mahdollisiksi terapeuttisiksi lääkkeiksi, glukagonireseptorin vähentynyt proteiiniekspressio ob/ob-hiirillä, jotka saivat koliinipuutosruokavaliota, voi jossain määrin selittää parantuneen glukoosinsietokyvyn. Maksan PGC-1α:n vähentynyt ilmentyminen oli samanaikainen PEPCK:n ja PDK4:n alenevan säätelyn kanssa, mikä osoittaa glukoosin vähentynyttä tuotantoa ja lisääntynyttä glukoosin hapettumista. β-HADH-aktiivisuuden alaregulaatio viittasi vähentyneeseen rasvahappojen hapettumiseen. Näihin prosesseihin liittyi vähentynyt mitokondriokompleksi II:n aktiivisuus, mikä saattaa heijastaa kompensoivaa vastetta vähentyneeseen mitokondrioiden hapetusstressiin. Näin ollen CD:n parantunut glukoosinsietokyky johtui vähentyneestä maksan glukoosintuotannosta ja lisääntyneestä glukoosin hyödyntämisestä. Tämä voisi tapahtua maksan glukagonireseptorin tukahduttamisen kautta, joka säätelee AMPK:ta adenylaattisyklaasin kautta ja siten moduloi PGC-1α:ta ja sen myöhempiä kohteita, kuten PEPCK:tä ja PDK4:ää, sekä maksan mitokondriaalista elektronin kuljetuskapasiteettia. Näin ollen tarvitaan lisätutkimuksia sen osoittamiseksi, voisiko glukagonireseptori olla uusi diabeteksen terapeuttinen kohde.

4.3. Rasvamaksan ja insuliiniresistenssin välinen yhteys

Rasvamaksan on osoitettu olevan lihavuudesta riippumaton tyypin 2 diabeteksen ennustaja. Lisääntyneillä solunsisäisillä rasvahapoilla uskotaan olevan syy-yhteys maksan insuliiniresistenssiin . Tässä tutkimuksessa koliinin puute pahensi rasvamaksaa, jossa havaittiin β-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiaktiivisuuden vähenemistä ja glyserolipalmitoyyliasyylitransferaasiaktiivisuuden lisääntymistä, mikä viittaa koliinin rooliin rasvahappoaineenvaihdunnan moduloinnissa. Näin ollen rasvahappojen ohjautuminen maksan triglyseridivarastoihin voi olla ensimmäinen suojamekanismi maksan solunsisäisten rasvahappopitoisuuksien alentamiseksi. Pitkäaikainen koliinin puute liittyy kuitenkin hepatosteatoosiin, hermostoputkivian riskiin sekä syöpäriskiin ja muistin heikkenemiseen , mikä saattaa rajoittaa koliinipuutteisen ruokavalion käyttöä lihavuuden ja insuliiniresistenssin pitkäaikaisena hoitostrategiana.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että koliinin puute voi ehkäistä painonnousua ja parantaa glukoosinsietokykyä lihavilla/ob-hiirillä. Runsaasti koliinia sisältävän ruoan saannin maltillinen rajoittaminen voi hyödyttää lihavia, prediabeettisia ja diabeettisia potilaita. Tuloksemme viittaavat uusiin mahdollisiin terapeuttisiin lähestymistapoihin.

Lyhenteet

Tekijöiden osuus

G. Wu ja L. Zhang osallistuivat työhön yhtä paljon.

Author Disclosure

Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Työtä on tuettu Kanadan terveystutkimusinstituutin myöntämällä apurahalla (MPG:llä) (MOP 89793).