MAP7:n roolin kartoittaminen aksonin kollateraalisessa haarautumisessa

Neuroneilla on moninaiset ja erilaiset dendriitti- ja aksonimorfologiat. Näiden rakenteiden asianmukainen kehitys on elintärkeää normaalin toiminnan ja kytkeytyvyyden kannalta. Epänormaali neuronimorfologia onkin yhdistetty erilaisiin neurobiologisiin ja psykiatrisiin häiriöihin (Luo ja O’Leary, 2005). Erilaisten aksonimorfologioiden kehittyminen riippuu kasvavien aksonien kyvystä reagoida solunulkoisiin vihjeisiin. Nämä vihjeet indusoivat paikallista sytoskeletaalista remodelingia aksonien kääntymistä ja haarautumista varten (Armijo-Weingart ja Gallo, 2017).

Aksonien kehitys DRG:n sensorisissa neuroneissa on hyvin stereotyyppistä, ja siksi se tarjoaa hyvän mallin aksonien haarautumisen mekanismin ymmärtämiseksi. Nämä sensoriset aksonit haarautuvat tullessaan selkäytimeen, ja tytäraksonit jatkuvat joko anteriorisesti tai posteriorisesti. Anteriorisesti kasvava aksoni nousee ylöspäin välittääkseen aivoihin tarkoitettua aistitietoa. Lisäksi nousevat ja laskevat aksonihaarat synnyttävät interstitiaalisia aksonikollateraaleja, jotka muodostuvat vakiintuneesta aksoniakselista innervoidakseen eri lamelleja selkäytimen dorsal-ventraaliakselin varrella (Gibson ja Ma, 2011).

Tymanskyj ym. (2017) pyrkivät hiljattain tekemässään työssä tunnistamaan proteiineja, jotka välittävät aksonien haarautumista DRG:n sensorisissa hermosoluissa. Tätä varten he vertasivat DRG-neuronien transkriptioprofiileja ennen ja jälkeen kollateraalihaarojen muodostumisen. Koska mikrotubuliin liittyvä proteiini 7 (MAP7) oli vahvasti ylösreguloitunut kollateraalien muodostumisen jälkeen, kirjoittajat tutkivat seuraavaksi MAP7:n yliekspression ja knockdownin vaikutuksia primaarisiin sensorisiin hermosoluviljelmiin, jotka oli kerätty varhaisessa ja myöhäisessä alkionvaiheessa. MAP7:n yliekspressio lisäsi interstitiaalisten haarojen määrää nuoremmissa neuroneissa, jotka eivät tyypillisesti ekspressoi MAP7:ää. Sitä vastoin MAP7:n tyrmääminen vanhemmissa neuroneissa, joita viljeltiin haarojen muodostumisen jälkeen in vivo, johti siihen, että interstitiaalisia haaroja oli vähemmän in vitro. Nämä kokeet osoittivat, että MAP7 on sekä riittävä että välttämätön interstitiaaliselle haarautumiselle sensorisissa neuroneissa.

Tymanskyj ym. (2017) päättelivät, että haarautumisen säätelijä lokalisoituu todennäköisesti aksonin alueille, joissa haaroja syntyy. Kirjoittajat löysivätkin MAP7:n vahvan preferenssin haarautumiskohdissa. Koska orastavat oksat muodostuvat filopodioista, joita mikrotubulusten tunkeutuminen vakauttaa, MAP7:n lokalisoitumisen ajoitus oksakohtiin viittaisi sen rooliin, joka säätelee oksan muodostumisen ajoitusta ja mallia. Kirjoittajat suorittivat siksi elävää kuvantamista ja totesivat, että fluoresoivasti merkitty MAP7 puuttui pioneeri-filopodeista, mutta sen pääsy uusiin mikrotubuluksilla rikastettuihin haaroihin oli viivästynyt. Jatkotutkimuksissa havaittiin, että MAP7 lokalisoitui ensisijaisesti pitkiin ja stabiileihin haaroihin. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että MAP7 on kriittinen haarojen kypsymiselle, mutta ei todennäköisesti alkuperäisen haaran muodostumiselle.

Vaikka nämä in vitro -käsittelyt osoittivat MAP7:n roolin sivuhaarojen haarautumisessa, kirjoittajat pyrkivät perustelemaan tämän käyttämällä hiirimutanttia, jossa MAP7-proteiini on typistetty C-päätepisteestä (MAP7mshi) (Turner ym. 1997). MAP7:n C-terminaalin oli aiemmin osoitettu olevan vuorovaikutuksessa kinesiinin kanssa (Sung ym., 2008; Barlan ym., 2013). Näin ollen Tymanskyj ym. (2017) päättelivät, että tämä oli aksonien haarautumisen mekanismi ja että MAP7mshi-neuroneilla olisi vähemmän kollateraaleja. Yllättäen MAP7mshi-hiiristä viljellyissä sensorisissa neuroneissa aksonien haarautuminen lisääntyi jyrkästi verrattuna kontrollieläinten neuroneihin. Tämä yhdistettynä aiempiin in vitro -löydöksiin viittaa vahvasti siihen, että MAP7:n N-pääte, eikä C-pääte, on elintärkeä aksonien kollateraalisen haarautumisen edistämisessä. Mielenkiintoista on, että jos C-pääte olisi välttämätön haarautumisen edistämiseksi, olisi järkevää olettaa, että MAP7mshi-neuronit olisivat samanlaisia kuin kontrollineuronit; sen sijaan MAP7:n C-päätteen menettäminen johtaa kuitenkin kollateraalisen haarautumisen voimistumiseen. Yksi selitys on, että C-terminaalinen domeeni estää N-terminaalisen toiminnan ja C-terminaalin menetys johtaa runsaaseen haarautumiseen. On myös mahdollista, että C-terminaalinen katkaisu tuottaa mutanttihiirissä epänormaalin suuria MAP7-proteiinipitoisuuksia, jotka edistävät aksonien haarautumista samaan tapaan kuin MAP7:n yliekspressio in vitro. Vaikka Tymanskyj et al. (2017) käyttivät in situ -analyysiä ja RT-PCR:ää vahvistaakseen typistetyn mRNA:n läsnäolon MAP7mshi-eläimissä, MAP7:n vertailukelpoiset ekspressiotasot ovat epäselviä. Näin ollen C-terminaalin tarkka säätelyrooli vaatii lisätutkimuksia.

Keskeinen löytö MAP7mshi-eläimistä tuli DRG:n sensoristen hermosolujen projektioiden analysoinnista. Aistineuronien on innervoitava asianmukaisesti sekä perifeeristä kohdekudosta, kuten ihoa ja lihasta, että selkäydintä muodostamalla useita aksonikollateraaleja molemmilla alueilla, jotta ne olisivat tarkasti herkkiä ulkoisille ärsykkeille. Mielenkiintoista oli, että MAP7mshi-hiirillä selkäytimeen haarautuvien aksonikollateraalien määrä lisääntyi kontrollieläimiin verrattuna, kun taas kollateraalien määrä etukäpälässä oli normaali. DRG-aksonien poikkeava innervoituminen selkäytimeen MAP7mshi-hiirillä liittyi lämpöhyperalgesiaan, mikä viittaa siihen, että DRG:n nosiseptorit ovat riippuvaisia MAP7:stä aksonien asianmukaisessa muodostumisessa. Se, vaativatko muut DRG-neuronien alatyypit MAP7:ää, vaatii lisätutkimuksia. Vaikka Tymanskyj et al. (2017) viljelivät heterogeenisen populaation sensorisia neuroneja dissosioituneista DRG: stä, he täydensivät näitä viljelmiä hermokasvutekijällä (NGF), joka tarjoaa trofista tekijää vain osajoukolle hermosolujen alatyyppejä (ts. nociceptorit) (Lallemend ja Ernfors, 2012). Muut DRG:n neuronien alatyypit (esim. proprioseptorit) eivät saa trofista tukea NGF:stä, joten ne jätettiin pois näistä viljelmistä (Lallemend ja Ernfors, 2012). Se, tukeutuvatko sekä nosiseptorit että proprioseptorit MAP7:ään, on erityisen mielenkiintoista, koska ne projisoituvat eri kohteisiin. Huomionarvoista kuitenkin on, että Tymanskyj et al. (2017) havaitsivat, että (1) vain osajoukko haaroista syntyi MAP7-rikastuneelta alueelta, (2) vain osajoukko MAP7-rikastuneita alueita aksonin varrella tuotti haaroja ja (3) MAP7mshi-hiirillä oli haarautumispoikkeavuuksia keskushermostossa mutta ei perifeerisissä projektioissa. Näin ollen on todennäköistä, että muut tekijät säätelevät haarautumista näissä aksoneissa.

Laaja työ on osoittanut, että ympäristön vihjeet muokkaavat aksonin haarautumista laukaisemalla hyvin säädellyn sytoskeletaalisten tapahtumien sekvenssin, mukaan lukien aktiinilaastareiden muodostuminen, filopodien ilmaantuminen ja mikrotubulusten polymerisaatio ja depolymerisaatio (Armijo-Weingart ja Gallo, 2017). Mikrotubulukseen assosioituneet proteiinit (Microtubule-associated proteins, MAP) voivat välittää sytoskelettimuutoksia vaikuttamalla positiivisesti tai negatiivisesti mikrotubulusten vakauteen ja niputtamiseen (Armijo-Weingart ja Gallo, 2017). Samanlainen kuin MAP7:n uusi rooli aistihaarojen kypsymisessä, aiemmissa töissä on tunnistettu MAP7:n rooli Sertoli-solujen mikrotubulusten stabiilisuudessa ja spermatogeneesissä, jossa MAP7:n puuttuminen hiirillä johtaa uroksen steriiliyteen (Komada et al., 2000; Magnan et al., 2009). Sitä vastoin Tymanskyj ja muut (Tymanskyj ym., 2012; Barnat ym., 2016) ovat tunnistaneet MAP1B:n aksonien haarautumisen ja kypsymisen negatiiviseksi säätelijäksi kortikaalisissa ja aikuisten DRG-neuroneissa. Nämä työt valaisevat sitä monipuolista proteiinityökalupakkia, joka on luontaisten haarojen kypsymisohjelmien käytettävissä. Kiehtova kysymys on, mikä ohjaa positiivisten ja negatiivisten säätelijöiden välistä kilpailua haarojen rakentamisen tai tuhoamisen välittämisestä.

Yksittäisestä neuronista lähtevät paikallisesti erilliset haarat voivat reagoida salliviin ja/tai rajoittaviin vihjeisiin. Kuten edellä mainittiin, Tymanskyj et al. (2017) havaitsevat, että MAP7mshi-hiirillä on poikkeavaa kollateraalista haarautumista selkäytimessä, mutta ei etukäpälässä, mikä viittaa siihen, että nämä toisistaan poikkeavat haarat reagoivat erilaisiin ympäristön vihjeisiin. Tämä MAP7-toiminnan ilmeinen rajoittuminen keskus- mutta ei perifeeriseen kollateraaliseen haarautumiseen heijastaa SAD-kinaasien yksipuolista toimintaa keskus- mutta ei perifeerisessä innervaatiossa proprioseptiivisissa neuroneissa, toisessa aistineuronien alatyypissä (Lilley et ai., 2013). Lilley et al. (2013) ehdottavat mallia, jossa SAD-kinaasit muotoilevat aksonihaaroja peräkkäisten pitkä- ja lyhytaikaisten neurotrofiinialtistusten kautta. Proprioseptiiviset neuronit saavat tonaalisen pitkäaikaisen altistuksen neurotrofiini-3:lle perifeerisistä kohteista, kuten lihaksesta, mikä johtaa SAD-kinaasi-ekspression ylössäätelyyn. Tämä ylössäätely pohjustaa aksonit sisäistä haarautumisen ohjelmointia varten, mutta tämä pohjustettu reitti käynnistyy vasta selkäytimen kohdehermosoluista, kuten motoneuroneista, peräisin olevan lyhytkestoisen neurotrofiini-3-altistuksen jälkeen, mikä indusoi runsasta haarautumista ventraalisessa selkäytimessä (Lilley ym., 2013). Sitä vastoin aksonien kuviointia muissa neuronien alatyypeissä voidaan ohjata erilaisilla solunulkoisilla vihjeillä. Esimerkiksi sympaattinen hermosto, toinen neurotrofiiniriippuvainen populaatio, reagoi kahteen eri neurotrofiseen vihjeeseen peräkkäisissä vaiheissa aksoniprojektion aikana. Sympaattiset aksonit kasvavat aluksi verisuonia pitkin, mikä on välikohde, joka erittää aksonin laajenemista edistävää neurotropiinia (Kuruvilla ym., 2004). Lopullisen innervaation yhteydessä aksonipäätteet altistuvat kuitenkin NGF:lle, jota kohdekudos tuottaa. Kohdekudoksesta peräisin oleva NGF indusoi signaalikytkimen, joka pysäyttää aksonin kasvun ja rohkaisee haarautumista, jotta kohteen laaja innervaatio olisi mahdollista (Suo ym., 2015). Ehkä MAP7-riippuvainen haarautumiskypsyminen perustuu myös joko (1) yhteen aksonikuvioinnin vihjeeseen, jolla on ajallisesti ja paikallisesti erilliset kuviot, tai (2) erilaisiin peräkkäisiin vihjeisiin väli- ja loppukohteista.

Neurologiset häiriöt voivat liittyä muuttuneeseen aksonikäyttäytymiseen ja aivojen kytkeytyneisyyteen, mikä osaltaan vaikuttaa niiden monitekijäiseen monimutkaisuuteen ja monitekijäisyyteen. Mielenkiintoista on, että MAP7 ilmentyy hiiren alkioaivoissa, ja hieno geneettinen kartoitustutkimus osoittaa merkittävää yhteyttä MAP7-yksinukleotidipolymorfismeissa skitsofreniaan (Fabre-Jonca et ai., 1998; Torri et ai., 2010; Venkatasubramanian, 2015). Tymanskyj ym. (2017) perifeerisessä hermostossa tekemiensä löydösten jälkeen on ratkaisevan tärkeää tutkia MAP7:n säätelyä aksonihaarojen kypsymisessä aivoissa, jotta voidaan selvittää MAP7:n ja skitsofrenian välistä yhteyttä. Lisäksi ääreishermoston kehityksen lisäksi aksonien sivuhaaroja tarvitaan koko hermostossa, ja ne ovat kriittisiä asianmukaisen johdotuksen kannalta. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että mikrotubulusten polymerisaatiota edistävien solun sisäisten ohjelmien aktivointi voi säädellä positiivisesti aksonien uudelleenkasvua ja haarautumista vamman jälkeen (Ruschel et al., 2015). Siksi mahdollisten terapeuttisten kohteiden havaitsemiseksi aksonien uudelleenkasvua varten tulevissa tutkimuksissa voidaan keskittyä MAP7:ään luontaisen kehitysohjelmoinnin uudelleen käynnistämiseksi.