Rajskubin ensimmäinen rooli oli Oompa-Loompa yhteisöteatterin tuotannossa Willy Wonka & suklaatehdas, ja hänen ensimmäinen pääroolinsa oli Raggedy Ann. Vuonna 1996 hän esiintyi musiikkivideoissa Weezerin kappaleille ”The Good Life” ja Beckin kappaleelle ”The New Pollution”.
Vuosina 1996-1998 hänellä oli toistuva rooli HBO:n The Larry Sanders Show -sarjassa varausassistentti Mary Lou Collinsina.
Hänen tunnetuin roolinsa on CTU:n systeemianalyytikko Chloe O’Brian 24-sarjassa, johon hän liittyi vuonna 2003 sarjan kolmannen tuotantokauden alussa. Hänen hahmonsa oli hitti katsojien ja kriitikoiden keskuudessa ja oli yksi harvoista näyttelijöistä, jotka palasivat sarjan neljännellä kaudella. Oltuaan vakituinen vieraileva tähti kahden kauden ajan Rajskubista tuli sarjan pääosan esittäjä sarjan viidennellä kaudella. Sarjan loppuun mennessä hän oli naispääosassa, ja hän oli toiseksi tärkein näyttelijä Kiefer Sutherlandin jälkeen. Hänen hahmollaan oli myös kunnia sanoa sarjan viimeiset sanat kahdeksannen kauden sarjan finaalissa. Rajskub ja Sutherland esiintyivät lyhyesti 24-hahmoina Foxin animaatiosarjan Simpsonit vuoden 2007 jaksossa ”24 minuuttia”. Elokuussa 2013 ilmoitettiin, että hän palaisi Chloe O’Brianin rooliinsa vuoden 2014 rajoitetussa sarjassa 24: Live Another Day.
Rajskub oli yksi Mr. Show’n alkuperäisistä näyttelijöistä. Hän esiintyi Kelsey Grammerin The Sketch Show -ohjelmassa Fox Televisionilla, The King of Queens -ohjelmassa Priscilla-nimisessä hahmossa sekä lukuisissa elokuvissa, kuten Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, musiikkivideot Beckille, Weezerille ja Sheryl Crow’lle sekä esittänyt sokeaa naista elokuvassa Road Trip.
Rajskub oli osa koomikkokaksikkoa (yhdessä Karen Kilgariffin kanssa) nimeltään Girls Guitar Club. Vuonna 2006 hän teki cameo-esiintymisen Gilmore Girls -sarjan kuudennen kauden finaalissa ”Partings”, jossa hän esitti suurta läpimurtoaan etsivää trobairitzia. (Rajskub oli aiemmin esiintynyt Gilmore Girls -sarjassa naispääosassa Kirkin lyhytelokuvassa A Film by Kirk, jonka hahmo Kirk Gleason teki). Hän on toiminut vapaaehtoisena näyttelijänä Young Storytellers -ohjelmassa. Hän on koulutukseltaan taidemaalari, sillä hän on käynyt San Franciscon taideinstituutin.
Rajskub on ollut kahdesti ehdolla Screen Actors Guild Award -palkinnon saajaksi; kerran vuonna 2005 ja uudestaan vuonna 2007 erinomaisesta näyttelijäsuorituksesta draamasarjassa. Hän vieraili Flight of the Conchordsin jaksossa ”Prime Minister” Art Garfunkel -fanaatikon Karenina. Hän esiintyi vierailevana näyttelijänä ”Gail the Snail” It’s Always Sunny in Philadelphia -sarjan jaksossa ”The Gang Gives Frank an Intervention” ja esitti roolinsa uudelleen yhdeksännen kauden finaalissa ”The Gang Squashes Their Beefs” ja kolmannentoista kauden jaksossa ”The Gang Beats Boggs”: Ladies Reboot”. Vuonna 2009 hän esiintyi myös elokuvassa Julie & Julia Sarahina, joka on yksi Julie Powellin läheisistä ystävistä. Vuonna 2010 Rajskub esitti stand-upia John Oliverin New York Stand Up Show’ssa. Kesäkuussa 2010 hän esiintyi USA:n Royal Pains -sarjan toisen kauden jaksossa ”Lovesick”.
Heinäkuusta lokakuuhun 2010 hän esiintyi sooloshow’ssaan Mary Lynn Spreads Her Legs Steve Allen Theaterissa Los Angelesissa. Los Angeles Timesin arvostelija F. Kathleen Foley kirjoitti, että ”tuo iloisen mauton nimi kiteyttää koko sävyn, joka on usein kevyesti säädytön”. Rajskubin ohjaaja/kehittäjä Amit Itelmanin avustuksella käsikirjoittama show on saanut inspiraationsa Rajskubin kokemuksista raskaudesta, synnytyksestä ja varhaisesta äitiydestä.
Tammikuussa 2011 Rajskub vieraili vierailevana näyttelijänä ABC:n Moderni perhe -sarjan toisella kaudella jaksossa ”Meidän lapsemme, meidän itsemme”. Syksyllä 2011 Rajskub esiintyi lyhytikäisessä komediasarjassa How to Be a Gentleman. Myös vuonna 2011 Rajskubin verkkosarja Dicki alkoi pyöriä My Damn Channelilla. Dicki perustuu useisiin ihmisiin, joiden parissa Rajskub kasvoi Michiganissa ja sen ympäristössä. Sarjan nimihenkilö on 40-vuotias nainen, joka asuu kotona vanhempiensa kanssa, tekee käsitöitä ja ottaa taiteensa vakavasti. Dicki on ollut yksi My Damn Channelin menestyneimmistä verkkosarjoista tähän mennessä. Ensimmäinen kausi päättyi marraskuussa 2011, mutta toinen kausi on parhaillaan kehitteillä. Rajskub esiintyi kesäkuussa 2012 Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), joka on kuukausittainen showcase, jossa julkkikset kertovat tositarinoita, joita he eivät haluaisi äitinsä tietävän. Tällä hetkellä hän isännöi Nerdist Networkissa podcastia nimeltä Kickin’ it Mary Lynn Style.
Vuonna 2013 Rajskub esiintyi Arrested Development -sarjan neljännellä kaudella hiljaisessa, mutta hyvin vastaanotetussa roolissa Heartfirenä, hahmona, jonka Rajskub on sanonut ”puhuvan sydämestään, mutta ei käyttävän sanoja”. Samana vuonna Rajskub esiintyi myös web-sarjassa All Growz Up Melinda Hillin kanssa.
Rajskub esiintyi Ken Reidin TV Guidance Counselor -podcastissa 27. maaliskuuta 2015.
Elokuussa 2016 Rajskub esiintyi Edinburghin Fringe-festivaaleilla elokuvassa 24 Hours With Mary Lynn Rajskub ja se sai hyvän vastaanoton faneilta ja kriitikoilta.
Vuonna 2017 Rajskub esiintyi Adult Swim -sarjan Dream Corp LLC:n ensimmäisellä kaudella näyttelemällä potilasta 46 jaksossa ”Are You Down With OCD?”.
Vuonna 2018 Rajskub esiintyi Night School -elokuvassa Kevin Hartin, Tiffany Haddishin, Rob Rigglen, Taran Killamin, Megalyn Echikunwoken, Al Madrigalin, Anne Wintersin, Fat Joen ja Keith Davidin vastapuolella.
Vuonna 2021 Rajskub julkaisi 49-minuuttisen komediaspesiaalin Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; sitä voi vuokrata tai ostaa useista video-on-demand-palveluista.