TULOKSET
Ehdokkaiden eläinten napa-alueen (APD) säätelygeenien tunnistaminen
Määritellaksemme APD:n varhaista säätelytilaa merisiilin alkiossa käytimme samanaikaisesti bioinformatiikkaa ja kokeellisia lähestymistapoja tunnistaaksemme säätelyvalkuaisaineita koodaavia geenejä, jotka ekspressoituvat sisäkkäisriitissä jo ennen mahalaukun gastrulaatiota. Bioinformatiikan lähestymistavassa hyödynnettiin laboratoriomme (Burke ym., 2006) ja muiden laboratorioiden (Howard-Ashby ym., 2006a; Howard-Ashby ym., 2006b; Materna ym., 2006; Tu ym., 2006) tekemiä genomisekvenssien annotaatiopyrkimyksiä, joissa dokumentoitiin APD:n ilmentymismallit monille geeneille, jotka koodasivat transkriptiotekijöitä ja/tai olivat ortologeja tekijöille, joiden tiedetään toimivan hermokudoksessa toisten lajien alkioiden alkioissa. Kokeellisessa lähestymistavassa verrattiin RNA:iden edustusta Δkadheriinin mRNA:ta ruiskutetuissa ja normaaleissa alkioissa kuoriutumisvaiheessa blastula-vaiheessa. Alkiot, joilta puuttuu ydinβ-kateniini, koostuvat lähes yksinomaan eläimen napaan kuuluvasta ektodermistä, kuten foxq2:n ja hbn:n ilmentymismallit osoittavat. Normaaleissa alkioissa nämä mRNA:t rajoittuvat eläimen napaan blastula-vaiheesta alkaen (Burke ym., 2006;Tu ym., 2006;Yaguchi ym., 2008), ja niiden ilmentymisalueet mesenchyymin blastula-vaiheessa ovat päällekkäisiä eläimen napassa (kuva 1B-D). Kehityksen edetessä gastrulaation läpihbn:tä ilmentävien solujen alue muodostaa renkaan, joka ympäröifoxq2:ta ilmentäviä soluja (kuva 1F). Kun kanoninen Wnt-, Nodal- ja BMP-signalointi eliminoidaan ΔcadherinmRNA-injektiolla, alkion eläinpuolisko ilmentää foxq2:ta, kun taas suurin osa alkion loppuosasta ilmentää hbn:tä (kuva 1H). Nämä kuviot osoittavat, että alkiot, joista puuttuu kanoninen Wnt- ja Nodal-BMP2/4-signalointi, koostuvat lähes kokonaan dramaattisesti laajentuneesta APD:stä, jonka ulkorajat on määritelty hbn-ekspressiolla. Foxq2- ja hbntranskriptejä esiintyy APD:ssä myöhäisessä pilkkoutumisvaiheessa/varhaisessa blastulavaiheessa, mikä osoittaa, että APD:n spesifikaatio tapahtuu ainakin tähän mennessä.
Δkadheriini-misexpressiiviset alkiot koostuvat foxq2:n ja hbn:n ilmentymisen määrittelemistä animal pole domain(APD)-kudoksista.Whole-mount in situ -hybridisaatiot alkioihin mesenchyme blastula(A-D)- ja gastrulae(E-H)-vaiheissa. (E,F) Glyseroli-injektoitu kontrolli. (G,H) Δcadherin-mRNA injektoituna. (A,E,G) DIC; (B-D,F,H) Kaksivärifluoresenssi, hbn (vihreä) ja foxq2 (magenta) RNA. Mittakaava: 20 μm.
Tunnistaaksemme varhaisia APD:tä sääteleviä geenejä vertasimme yksittäisten mRNA:iden suhteellisia pitoisuuksia Δcadherinin mRNA:ta sisältävissä ja glyseroliin ruiskutetuissa alkioissa kuoriutumisvaiheessa blastula-asteikolla käyttäen mikrosarrayta, joka edustaa kaikkia merisiilin genomisekvenssistä löytyviä geeniennusteita(Wei ym., 2006). Tämä vaihe merkitsee siirtymävaihetta pilkkoutumisen ja morfogeneesin alkamisen välillä, ja se tapahtuu pian sen jälkeen, kun APD:n varhaisimmat merkkiaineet on havaittu (Burke ym., 2006;Howard-Ashby ym., 2006a;Howard-Ashby ym., 2006b;Tu ym., 2006;Yaguchi ym., 2008). Tunnistettiin joukko geenejä, jotka koodaavat transkriptiotekijöitä ja signaalireittien komponentteja ja joiden ekspressio oli keskimäärin vähintään kolminkertainen kahdessa erässäΔkadheriinin mRNA:ta ruiskutettuja alkioita. Nämä geenit olivat osittain päällekkäisiä bioinformatiikan avulla tunnistettujen geeniehdokkaiden kanssa. Yhdistetyt joukot sisältävät 27 geeniä ja muodostavat alustavan APD:tä säätelevän geenijoukon (E-APD)(taulukko 1).
- Katso rivissä
- Katso ponnahdusikkunassa
E-APD-joukkoon kuuluvien geenien herkkyys ydinβ-kateniinin häviämiselle
Esimerkiksi E-APD-joukon varhaisimmin ilmentyneiden geenien tunnistamiseksi tarkastelimme mikrosirujen tuottamia ajallisia ilmentymisprofiileja aiemmin kuvatulla tavalla (Wei et al., Kuviot tarkistettiin vertaamalla niitä julkaistuihin tietoihin (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) ja kokomittaisilla in situ -hybridisaatioillamme (julkaisemattomat havaintomme). Geenit lajiteltiin kolmeen ryhmään: ne, jotka olivat maksimaalisesti edustettuina synnynnäisessä RNA-populaatiossa (kuva 2A), ne, jotka olivat voimakkaasti säänneltyjä pilkkoutumisvaiheiden aikana (kuvat 2B,C) ja ne, jotka olivat säänneltyjä myöhäisen pilkkoutumisvaiheen ja varhaisen gastrula-vaiheen välillä (kuva 2D). Keskityimme ensin varhaisen alkion ekspressioryhmän jäseniin. Kuten jäljempänä osoitetaan, tunnistimme sekä loss- että gain-of-function-testien avulla yhden, Sp-Six3:n (jäljempänä Six3), joka toimii APD:n geneerisen säätelyhierarkian huipulla tai lähellä sitä.
Six3 ilmentyy APD:n varhaisessa vaiheessa
Merisiilin six3:n tunnistaminen on yksiselitteistä, koska sen sekvenssi on hyvin pitkälle konservoitunut homeodomeenin (98 % identtinen HsSix3:n kanssa), six-domeenin (91 %) ja groucho-vuorovaikutusdomeenin (71 %) osalta (ks. kuvio S1 lisämateriaalissa). Vahvistimme aiemmat tutkimukset, joiden mukaan Six3 ilmentyy dynaamisesti tässä tutkimuksessa käytetyn Strongylocentrotuspurpuratusin kanssa läheisessä sukulaisuussuhteessa olevan Paracentrotus lividus -lajin (Poustka etal., 2007) kehityksen aikana. Tärkeimmät piirteet ovat, ettäSix3-transkriptit ilmentyvät eläinpuoliskossa myöhäisen koteloitumisen aikana (kuva 3A), APD:ssä kuoriutuneessa blastulavaiheessa (kuva 3B) ja sen jälkeen kahdessa renkaassa (kuvat 3G,H), joista toinen on lähellä APD:n reuna-aluetta (kuvat 3C-F,H) ja toinen endomesodermissä (kuvat 3C-G), mesenchyma-blastulavaiheessa. Gastrulaation aikana Six3 ekspressoituu joissakin sekundaarisissa mesenkiimisoluissa, jotka ovat hajallaan koko blastokotelossa ja archenteronin kärjessä (kuva 3I, nuoli), kuten Howard-Ashby ym. ovat raportoineet (Howard-Ashby ym., 2006b), eläimen napaosan soluissa (kuva 3I,J) ja oraalisessa ektodermissä (kuva 3J,K). Pluteusvaiheessa Six3 RNA:ta havaitaan kahdessa suuaukkoa reunustavassa solurykelmässä(kuva 3K, nuolet) ja suulakikaistaleessa (kuva 3K).
Sixin mRNA:n kokonaistasot varhaisessa mesenkyymin blastulavaiheessa eivät muutu merkittävästi Δkadheriinin mRNA-injektion vaikutuksesta(taulukko 1). In situhybridisaatiot ovat johdonmukaisia tämän tuloksen kanssa ja osoittavat, että jakauma eroaa Δkadheriinin mRNA:ta ruiskutetuissa alkioissa, sillä se puuttuu kasvisoluista ja säilyttää laajan eläinpuoliskon ilmentymisen, joka vakiintuu ennen rajoitusta kanonisesta Wnt:stä riippuvaisilla prosesseilla (ks. kuva.
Six3:n toimintaa tarvitaan APD:n muodostumiseen ja hermosolujen erilaistumiseen
Testataksemme Six3:n toimintaa ruiskutimme hedelmöittyneisiin munasoluihin kaksi erilaista Six3:n translaatiota estävää morfolinoa, joista kumpikin aiheutti samat kehityshäiriöt. Alkioiden morfologia oli 3 päivän iässä pyöreä (kuvat 4A,B), ja piikit olivat joko vähentyneet tai puuttuivat. Eläinnavan ektodermistä puuttui eläinlevylle ominainen paksuuntunut epiteelimorfologia (kuva 4, vertaa A,B ja C,suluissa). Joissakin alkioerissä gastrulaatio tapahtui normaalisti, vaikkakin viiveellä, ja arkkenteronin sijainti osoitti, että oraalinen/aboraalinen napaisuus oli vakiintunut (kuva 4A). Toisissa erissä suurin osa alkioista eksogastruloitui. Alkioissa, joista puuttui Six3, neuraalinen erilaistuminen oli voimakkaasti estynyt, mikä osoitettiin immunovärjäyksellä neuraalisille merkkiaineille, jotka normaalisti ilmentyvät lategastrula- ja pluteusvaiheissa (kuva 4, vertaa A, B ja C). Suurin osa (2/3) alkioista sisälsi noserotonergisia hermosoluja, ja lopuilla alkioiden määrä oli vähentynyt (kuva 4D) verrattuna normaaliin määrään tässä vaiheessa (3-5). Sama päti kaikkiin muihin neuroneihin, jotka määritettiin pan-neuraalisella merkkiaineella synaptotagmiinilla (1e11) (kuvat 4A,B), jota esiintyy normaalien 3 päivän alkioiden APD:ssä ja sädekehäkaistaleessa (kuva 4C). Merkittävää on, että hbn:n ilmentyminen väheni tasolle, jota ei voitu havaita in situhybridisaatiolla (kuva 4F vs. kuva 4E). QPCR-mittaukset vahvistivat tämän havainnon ja osoittivat, että sekä hbn:n ettäfoxq2:n mRNA:n tasot, jotka merkitsevät APD:n ulkorajoja ja sisäosia, olivat pienentyneet 8-10-kertaisiksi Six3-morfanteissa teemenchyme blastula -vaiheessa (kuva 5).
Alustavan varhaisen APD-joukon geenien ajalliset ilmentymisprofiilit. Profilointimenetelmät olivat Wein ym. kuvaamat (Wei ym., 2006). Arvot eri hedelmöittymisen jälkeisinä tunteina 2-72 esitetään prosentteina maksimaalisesta signaalin intensiteetistä kunkin geenin osalta 2-soluisena (äidin RNA), 15 tunnin aikaisessa blastulassa (EB), 30 tunnin myöhäisessä mesenkyymiblastulassa (LMB), 48 tunnin lategastrulassa (LG) ja 72 tunnin pluteus-toukassa (PL). Profiilit on ryhmitelty varhaisimman havaittavan ilmentymisen ajankohdan mukaan: (A) maternaalinen;(B,C) varhainen blastula; (D) varhainen blastula – mesenchymeblastula. Katkoviivan sijainti kuvaa määritysajankohtaa Six3-morfanteissa. Six3-geenin tiedot on korostettu punaisella nuolella.
Six3:a tarvitaan useimpien E-APD-sarjan geenien ilmentymiseen
Six3:n menettämisen tuottama silmiinpistävä fenotyyppi sekä sen varhainen ilmentyminen alkiossa viittasivat siihen, että se saattaisi toimia lähelläAPD-geenien säätelyverkoston yläosaa. Tutkiaksemme tätä mahdollisuutta tarkemmin käytimme mikrosarray-analyysiä etsiessämme Six3:sta riippuvaisia geenejä 27 tunnin kohdalla, jolloin E-APD-joukon geenit lähestyvät maksimaalista ilmentymistasoa. Six3:n endomesodermaalisten toimintojen eliminoimiseksi suoritimme tämän seulanΔkadheriini-injektoiduilla alkioilla. Kuten kuvasta 5A käy ilmi, Six3:n menetys näissä alkioissa poisti kokonaan kaikkien ylimääräisten hermosolujen kehityksen, joita havaittiin Δkadheriini-injektoiduissa alkioissa, eikä paksuuntunutta epiteeliä muodostunut, mikä osoittaa Six3:n tärkeän roolin APD:n kehityksessä. Microarraydatassa tunnistettiin yllättävän suuri määrä geeniennusteita (682), jotka olivat voimakkaasti alasreguloituja (vähintään 4-kertaisesti) alkioissa, joihin oli injisoitu kahdestiΔkadheriini-mRNA:ta ja Six3-MO:ta, verrattuna alkioihin, joihin oli injisoitu vainΔkadheriini-mRNA:ta. Lisäksi yli 60 prosenttia kaikista edellisessä mikrosiruseulonnassa olleista geeneistä, jotka olivat vähintään kolminkertaisesti säänneltyjäΔkadheriini-mRNA:ta ruiskutetuissa alkioissa ja jotka näin ollen todennäköisesti ilmentyivät APD:ssä, olivat merkittävästi alasreguloituneita Six3:n häviämisen seurauksena. Tärkeää on, että mikrosirutiedot osoittivat, että suurin osa E-APD-geeneistä oli herkkiä Six3:lle (kuva 5B, keltainen). QPCR-mittaukset kahdessa muussa alkioerässä osoittivat, että vain 5 E-APD-geeniä ei riippunut merkittävästi Six3:sta (kuva 5B, punainen, sininen).
Six3:n yliekspressio riittää laajentamaan APD:tä
Nämä tulokset tukevat vahvasti ajatusta siitä, että Six3 toimii varhaisessa vaiheessa APD-geenien säätelyverkostoissa, ja tuovat esiin mahdollisuuden, että se saattaa riittää indusoimaan muita soluja alkiossa omaksumaan APD:n kohtaloita.Six3:n aliekspressio johti alkioihin, joilla oli poikkeuksellinen muutos morfologiassa. Tiiviisti pakattujen solujen hevosenkengänmuotoinen kaistale ulottui kasvusuuntaan eläimen navasta (kuva 6, vertaa B, C ja A).Serotonergiset neuronit, jotka normaalisti rajoittuvat eläinlevyyn (kuva 6D), lisääntyivät nelinkertaisesti ja jakautuivat tiheän kaistaleen varrelle (kuva 6G). Lisäksi synaptotagmiinia sisältävien solujen (1e11) hermoprojektioiden pylväsmuodot ja sijoittelu ovat samanlaisia kuin kontrollialkioiden eläinlevyssä (kuva 6E, valkoinen katkoviivoitettu laatikko verrattuna kuvaan 6H). Kaikkien näiden solujen ytimissä on NK2.1 (kuva 6J-M, vihreä), transkriptiotekijä, joka ilmentyy normaalisti eläinlevyssä ja sitä ympäröivässä supraoraalisessa ektodermissä (kuvat 6I, I′; vihreät ympyrät kuvassa 6U) sekä muutamissa eturauhasen soluissa (Takacs ym., 2004). Kaistaleen halkaisee 1e11-positiivisten hermosolujen ketju (kuva 6K, punainen), ja NK2.1-positiivisen kaistan sisäpuolella olevat solut ilmentävät myös Gsc:tä (kuva 6L,N, punainen). NK2.1:n ja Gsc:n yhdistelmä merkitsee yksiselitteisesti supraoraalista kasvojen epiteeliä eläinlevyn suun reunalla (kuvat 6I,I′, keltaiset solut ja kuva 6U, keltaiset ympyrät). Laajentuneen kaistaleen tiheästi pakkautuneet pylväsmäiset solut ympäröivät litteämpiä epiteelisoluja, jotka ilmentävät NK2.1:tä, mutta eivät Gsc:tä (kuvat 6M,N), kuten normaalien alkioiden suun ylempien alueiden solut (kuvat 6I, suu, m). Lisänäyttöä siitä, että nämä solut ovat samanlaisia kuin normaalien alkioiden suun läheisyydessä olevat solut, on se, että ne ilmentävät hbn mRNA:ta, joka normaaleissa 3 päivän alkioissa kerääntyy eläinlevyn reunan ympärille ja ulottuu supraoraaliseen ektodermiin (kuva 1, kuva 6O). Six3-misekspressoivissa alkioissa hbn-positiiviset solut ovat keskittyneet ohueen epiteeliin kasvisnavan kohdalla ja sijaitsevat siten samassa paikassa suhteessa laajentuneeseen eläinlevyyn ja Nk2.1-positiivisiin soluihin ylemmässä eturauhasessa kuin normaaleissa alkioissa (kuvat 6P,Q). Suun alueen vastakkainen puoli erilaistuu ohueksi epiteeliksi, ilmentää aboraalisen ektodermin merkkiainetta Spec1 (kuva 6R-T) ja saattaa vastata eläinlevyn vieressä olevaa hbn-positiivista aboraalisen ektodermin kaistaletta. Yhdessä nämä geenien ilmentymismallit johtavat huomattavaan johtopäätökseen, että Six3 riittää määrittelemään uudelleen solujen kohtalot suurimmassa osassa alkion muuta osaa, jolloin syntyy 3 päivän alkio, joka koostuu huomattavasti laajentuneesta, mutta oikein kuvioidusta eläimen napa-alueesta, jolla on suu/oraalinen/aboraalinen napaisuus. APD normaaleissa ja Six3:aa ekspressoivissa alkioissa on merkitty sinisillä ympyröillä kuvassa 6U.
Kokonaan asennettu in situ -hybridisaatio Six3 mRNA:n osalta kehityksen aikana. Ajat tunteina hedelmöittymisen jälkeen on esitetty kunkin kuvan oikeassa yläkulmassa. (A) Hyvin varhainen blastula. (B) Kuoriutuva blastula. (C-H) Mesenkyymiblastula. (I,J) Lategastrula. (K) Pluteus. Kaikki alkiot on esitetty sivukuvassa, paitsi kohdissa G ja H, jotka kuvaavat kasvin napaa (vv) ja eläimen napaa (apv). Nuolet I:ssä ja K:ssa merkitsevät sekundaaristen mesenkyymisolujen ja suuta reunustavien solujen sijainnit. Mittakaavapalkki: 20 μm.
Six3:n menetys johtaa hermosolujen häviämiseen ja APD:lle tyypilliseen paksuuntuneeseen epiteeliin. (A,B) Kolmen päivän alkiot, joihin on injektoitu Six3-MO2 yhden solun vaiheessa, jotka ovat tyypillisiä vahvemmille ja heikommille fenotyypeille. (C) Normaali 3 päivän alkio. A-C:n APD merkitty suluissa; 1e11 (pan-neuraalinen, magenta), serotoniini (vihreä), DAPI (ytimet, sininen). (D) Alkioiden lukumäärät, jotka sisältävät joko 0, 1, 2 tai 3 serotonergistä hermosolua alkiota kohti Six3-morfanteissa. Tässä vaiheessa normaaleissa alkioissa on 3-5 serotonergistä neuronia. (E,F)hbn mRNA normaaleissa mesenkyymiblastuloissa (E) tai Six3-morfanteissa (F).Mittakaavapalkki: 20 μm.
Koska misexpressoitu Six3 voi laajentaa koko APD:tä ja edistää ektooppisten neuronien kehittymistä, kysyimme, mitkä geenit E-APD-geenisarjassa olivat säädeltyjä, käyttäen microarray- ja QPCR-mittauksia.Taulukossa 2 on lueteltu 10 tällaista geeniä, joiden mRNA-tasot ovat kohonneet vähintään 3-kertaisiksi Six3 mRNA:ta ruiskutetuissa alkioissa.
- Katso rivissä
- Katso ponnahdusikkunassa
Six3-misekspressoivissa alkioissa ylösreguloituneet geenit
Six3 voi tukahduttaa TGF-β-signalointia, mutta ei eliminoi oraalista/aboraalista polariteettia
Six3-misekspressio ei eliminoi oraalista/aboraalista polariteettia, koska oraalisen jaaboraalisen ektodermin merkkiaineet ekspressoituvat alkion vastakkaisilla puolilla, ja normaalisti APD:ssä olevat neuronit rajoittuvat välikaistaleeseen.Misexpressoitu Six3 vähentää kuitenkin nodaalisen sekä lefty:n ja chordinin ilmentymistä mesenchyymiblastuloissa (taulukko 3, vasen), ehkä siksi, että Six3 antaa positiivisen syötteen FoxQ2:n ilmentymiselle, jonka on osoitettu tukahduttavan nodaalista ilmentymistä (Yaguchi ym.), Yllättäen Six3 ei tukahduta bmp2/4 mRNA:n kertymistä yhtä paljon kuin se vähentää nodaalista, vaikka bmp2/4:n ilmentyminen edellyttää nodaalista toimintaa normaaleissa alkioissa (Duboc ym., 2004). Tämä näennäinen paradoksi voi johtua BMP2/4-signaalin vähentyneen Chordin-välitteisen eston ja BMP2/4:n diffuusion ja sitä seuraavan autoaktivoitumisen yhdistelmästä, kuten on osoitettu muissa järjestelmissä (Biehs et al., 1996;Jones ym., 1992).
- Katso inline
- Katso popup
Signaalireitin komponenttien
Varhaisen APD:n säätelygeenien herkkyys Six3:n menetykselle (A) Kolmen päivän alkiot, joihin on injektoitu Δkadheriini-mRNA:ta (ylhäällä) taiΔkadheriini-mRNA:ta ja Six3-MO:ta (alhaalla). Nuoli osoittaa eläin-kasvi-akselin suuntautumisen. Alkiot on immunovärjätty anti-serotoniinilla ja1e11:llä, joka on pan-neuraalinen merkkiaine. (B) QPCR-syklimuutokset (siniset ja punaiset pylväät)tai log2-signaalin intensiteettierot (keltaiset pylväät) (y-akseli, vasemmalla) tai kertaistuneet muutokset (y-akseli, oikealla) yksittäisten mRNA:iden tasoissa kahdessa erässä (punaiset ja siniset pylväät) Six3-morfantti- ja kontrolloiduissa 27 tunnin alkioissa, jotka kumpikin sisälsivät Δkadheriinia. Geenit, joiden ekspressio on muuttunut vähintään 3-kertaiseksi, ovat vihreän viivan vasemmalla puolella.
Kanoniset Wnt-, ei TGF-β-signaalit estävät APD:n laajenemisen lateraaliseen ektodermiin
Signaalit, jotka rajaavat APD:n, ovat riippuvaisia kanonisesta Wnt-signaalistosta, sillä sen eliminoinnin ansiosta APD:n on mahdollista kattaa melkein koko alkio(Yaguchi ym., 2006)(Kuva 1). Koska Nodal ja BMPriippuvat kanonisista Wnt-signaaleista, eliminoimme molemmat TGF-β-ligandit Nodal-MO:lla (Yaguchi ym.,2008) testataksemme, ovatko ne vastuussa Wnt:stä riippuvaisesta APD:n rajoittumisesta. Kuva 7B,F osoittaa, että näin ei ole, koska serotonergiset neuronit rajoittuvat edelleen APD:hen näissä alkioissa. Kun Nodal-morfantit saavat kuitenkin eksogeenista Six3:a, serotonergisten neuronien määrä lisääntyy huomattavasti ja niitä esiintyy koko alkion eläinpuoliskolla (kuva 7D), kuten on havaittuΔkadheriini-misexpressoivissa alkioissa (Yaguchi ym., 2006), mikä heikentää kanonista Wnt-signalointia. Siksi Six3:n ektooppinen ilmentyminen voi ohittaa muut signaalit, oletettavasti Wnt:n, jotka rajoittavat nämä neuronit normaalien alkioidenAPD:hen.
Vaikka serotonergiset neuronit eivät muodostu lateraaliseen ektodermiin Nodalmorfanteissa, jotkin ei-serotonergiset neuronit kuitenkin muodostuvat(kuva 7B). Tämä johtuu ensisijaisesti, joskaan ei yksinomaan, BMP2/4-signaalin katoamisesta, sillä sama tulos saadaan BMP2/4-MO-injektoiduissa alkioissa (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.A. ja R. D. Burke, julkaisematon). Koska kaikkien hermosolujen kehitys riippuuSix3:sta normaalissa alkiossa, kysyimme, riippuvatko myös Nodalmorfanttien ektooppiset hermosolut Six3:sta injektoimalla samanaikaisesti Nodal-MO:ta ja Six3-MO:ta. Odotetusti Nodalmorfanttien eläimen napassa olevat serotonergiset neuronit hävisivät kaksoismorfanteissa (kuvat 7G,H). Näissä alkioissa ei ole erilaistuneita ei-serotonergisiä neuroneja, joilla on aksoniprosessit, vaikka joitakin 1e11-immunoreaktiivisia pisteitä havaittiin. Nämä saattavat viitata epätäydellisesti erilaistuneiden neuronien läsnäoloon tai kuvastaa ektodermisolujen alkuperäistä neuraalista vinoumaa, joka normaalisti kumoutuu TGF-β-signaalin vaikutuksesta.
Six3 voi vastustaa Wnt-signalointia
Totuudet siitä, että APD ei laajene Nodal-morfanteissa mutta laajeneeΔkadheriini-injektoiduissa alkioissa, ja siitä, että Six3 voi kumota kanonisetWnt-riippuvaiset vaikutukset lateraalisessa ektodermissä, herättävät ajatuksen siitä, että Six3 tukahduttaa Wnt-signalointia. Tämän hypoteesin tueksi havaitsimme, että Six3misekspressio alentaa useimpien Wnt-ligandeja koodaavien geenien säätelyä, jotka ekspressoituvat varhaisen kehityksen aikana (taulukko3, vasemmalla) (kuva 8).Yksi näistä on Wnt8, joka on tärkeä kasvullisen signaalin lähde, jota tarvitaan normaaliin endomesodermikehitykseen (Wikramanayake ym., 2004), mikä tulos on johdonmukainen kasvullisen kehityksen puuttuessa Six3:n misekspressoiduissa alkiossa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että APD:n rajat määräytyvät Six3/Wnt-antagonismin perusteella.
Six3 ei riitä tukahduttamaan wnt:n janodalin ilmentymistä APD:ssä
Six3:n kyky alentaa voimakkaasti (suoraan tai epäsuorasti) geenejä, jotka koodaavat Wnt:n ligandeja sekä nodaalia, lefty:tä ja chordin:ia, herättää ajatuksen siitä, että se normaalisti estää näiden geenien ilmentymisen APD:ssä. Tämän arvioimiseksi tutkittiin ensin Six3:n vaikutuksia geeniekspressioon Δkadheriini-injektion saaneissa alkioissa, jotta voitaisiin eliminoida Six3:n toiminnan mahdolliset vastakkaiset vaikutukset endomesodermissa. Sekä microarray- että QPCR-tiedot osoittavat, että pääasiassa APD:stä koostuvissa alkioissa Six3 tukahduttaa Wnt-geenien sekä nodal-, lefty- jachordin-geenien ilmentymisen (taulukko 3; kuva 8). Normaaleissa alkioissa (glyseroliin ruiskutetuissa) näiden geenien Six3:n repressiota ei kuitenkaan voida havaita(taulukko 3;kuva 8), mikä osoittaa, että lisämekanismit suojaavat APD:tä Wnt:n ja TGF-β:n ilmentymiseltä normaalissa alkiossa.
Six3:n säätely muissa signalointireiteissä
Six3 säätelee myös positiivisesti (joko suoraan tai epäsuorasti) geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka toimivat muissa signalointireiteissä(taulukko 3). Näihin kuuluivat Notch-ligandi Delta, joka välittää lateraalista inhibitiota, joka on keskeinen prosessi hermoston kehityksessä, sekä muita mahdollisia neurogenssin säätelijöitä. Viimeksi mainittuihin kuuluvat fgf9/16/20, fgfr:n kaltainen, kalvoon sidottu reseptori, josta puuttuu tyrosiinikinaasidomeeni, ja frizzled5/8, Wnt-reseptori, joka saattaa välittää ei-kanonisia signaaleja, mutta jonka toimintaa APD:ssä ei tunneta (Croce etal., 2006). Tulevissa tutkimuksissa tutkitaan, miten näiden signaalireittien ja varhaisten Six3-riippuvaisten transkriptiotekijöiden toiminta on vuorovaikutuksessa APD:n geenisäätelyverkossa.
Six3:n ekspressio muuttaa alkion laajentuneeksi APD:ksi. Allembryot ovat 3 päivän ikäisiä. (A) Normaali alkio, DIC; blastopore-näkymä, oralup. (B,C) Six3 mRNA:ta misekspressoivat alkiot, DIC; (B)oraalinen näkymä, (C) lateraalinen näkymä; nuolet B:ssä osoittavat rajan laajentuneen eläinlevyn ja kasvullisemman ohuen epiteelin välillä.(D,E) Serotonergiset (sero, vihreä) ja kaikki (1e11, magenta) neuronit normaaleissa alkioissa. (F-H) DIC- ja immunovärjäykset, kuten D:ssä ja E:ssäsix3 mRNA:ta ilmentävistä alkioista; oraalinen näkymä, eläinpylväs ylöspäin.(I,I′) Normaalien 3 päivän alkioiden immunovärjäykset NK2.1:n (vihreä) ja Gsc:n (magenta) osalta; (I) lateraalinen näkymä; solut APD:ssä oikealla valkoisen katkoviivan oikealla puolella; (I′) oraalinen näkymä, solut APD:ssä ovat valkoisten katkoviivojen välissä. Nuolenkärjillä merkityt NK2.1-positiiviset solut ovat blastocoelissa eivätkä kuulu APD:hen; m, suu. (J-T) six3-mRNA:ta ekspressoivat alkiot. (J,K) NK2.1 (vihreä); 1e11 (magenta).(L-N) NK2.1 (vihreä); Gsc (magenta). (O-Q) DIC-kuvat hbnwhole-mount in situ -hybridisaatioista kontrollialkioille (O) ja six3mRNA:ta ruiskutetuille alkioille (P,Q); eläimen napa ylöspäin; valkoinen ympyrä O:ssa merkitsee suuta. (R-T) DAPI:lla värjätty alkion läpileikkaussarja ja1e11 (vihreä) ja Spec1 (magenta) -epitooppeja varten; Spec1 merkitsee ohutta, laajenevaaaboraalista epidermistä, joka luhistuu ja ryppyyntyy preparoinnissa. (U)Kaavio, joka havainnollistaa APD-solutyyppien jakautumista normaaleissa jaSix3-mRNA:ta misekspressoivissa alkioissa. Värilliset pisteet osoittavat ilmoitettuja proteiineja tai mRNA:ta ilmentävien solujen jakautumisen, ja mustat ja violetit soikiot osoittavat serotonergiset (Sn) ja ei-serotonergiset neuronit (n-Sn).Vihreällä ja sinisellä varjostuksella on merkitty kasvojen epiteeli ja sädekehä. Six3 mRNA:n injektio (nuoli) saa aikaan pallomaisen 3 päivän alkion (oikealla; katso myös B, C), joka koostuu suurelta osin normaalissa alkiossa (vasemmalla) sinisellä rajatusta alueesta. Six3-mis-ekspressoivassa alkiossa neuronien ja NK2.1/gsc-positiivisten (keltainen; supraoraalinen) solujen määrä kasvaa huomattavasti, jahbn-positiivisia soluja (sininen), jotka tässä vaiheessa normaalisti reunustavat eläinlevyä oraalisella puolella, on kasvullisella napalla. Nuolet osoittavat oraali-oraalisen ja eläin-vegetaalisen akselin sijainnit sekä normaaleissa ettäSix3-misekspressiivisissä alkioissa. Mittakaavapalkit: 20 μm.
.