Haluatko alkaa käyttää verinäytteitä translaatiotutkimuksessasi? Ehkä olet kiinnostunut metastaattisesta rintasyövästä tai ei-pienisoluisesta keuhkosyövästä. Tai ehkä kiinteiden kasvainnäytteiden haasteet ja rajoitukset saavat sinut ajattelemaan… on aika.
Mitä nyt?
Katsotaanpa tarkemmin DNA:n tuottoa ja plasmasta saatavan soluvapaan DNA:n kanssa työskentelyn todellisuutta. Soluvapaalla DNA:lla (tai cfDNA:lla) tarkoitetaan kaikkea verenkierrossa olevaa kapseloimatonta DNA:ta. Osa tuosta soluvapaasta DNA:sta on peräisin kasvainkloonista, ja sitä kutsutaan kiertäväksi kasvain-DNA:ksi (circulating tumor DNA tai ctDNA). cfDNA on nukleiinihappofragmentteja, jotka päätyvät verenkiertoon apoptoosin tai nekroosin aikana. Normaalisti makrofagit puhdistavat nämä fragmentit, mutta uskomme, että syövän solujen ylituotanto jättää jälkeensä enemmän cfDNA:ta. Nämä fragmentit ovat keskimäärin noin 170 emäksen pituisia, niiden puoliintumisaika on noin kaksi tuntia, ja niitä esiintyy sekä varhais- että myöhäisvaiheen taudissa monissa yleisissä kasvaimissa, kuten ei-pienisoluisissa keuhko- ja rintakasvaimissa. Tästä huolimatta cfDNA:n pitoisuus vaihtelee suuresti, ja sitä esiintyy 1-100 000 fragmenttia millilitrassa plasmaa.
Jos olet ollut seuraavan sukupolven sekvensoinnin parissa jonkin aikaa, saatat haluta tietää herkkyydestä ja spesifisyydestä. Osoitimme korkean herkkyyden ja spesifisyyden varianttien osalta, joiden frekvenssi on yli 0,1 prosenttia 20 nanogramman panos-DNA:lla ja yli 0,5 prosenttia 5 nanogramman DNA:lla . Jos haluat lisätietoja siitä, miten tämä tehdään, katso video cfDNA-määrityksistä. Olet ehkä kuullut cfDNA:n käyttämisestä analyyseihin, joiden havaitsemisraja on nolla prosenttia. Vaikka teknologia on olemassa 0,01 prosentin saavuttamiseen (esimerkiksi digitaalinen pisara), on olemassa biologinen raja, josta meidän on puhuttava.
Kymmenen millilitran verinäytteestä saamme Applied Biosystems MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kitillä rutiininomaisesti noin 20 nanogrammaa cfDNA:ta eli noin kuusi käyttökelpoista molekyyliä analyysiä varten. Nopea laskutoimitus osoittaa, että 1 prosentin toteamisrajalla voimme odottaa noin 25 molekyyliä. Kun raja-arvo on 0,1 %, molekyylejä odotetaan olevan vain 2-3. Tämä tarkoittaa, että alle 0,1 prosentin kohdalla ei välttämättä ole yhtään molekyyliä analysoitavaksi. Muista myös, että cfDNA:n pitoisuudet vaihtelevat suuresti. Ne voivat olla hyvin alhaisia kriittisissä vaiheissa, kuten varhaisessa uusiutumisvaiheessa tai resistenssin kehittyessä, mihin monet tutkijat nyt keskittyvät. Jotta 20 nanogramman DNA:n eristäminen veriplasmasta onnistuisi, käytettävissä on sekä manuaalisia että automatisoituja menetelmiä läpimenotarpeiden mukaan.
DNA:n saaminen käteen, tutkimuksesi sanelee, mitä polkua tässä vaiheessa valitset. Saatat valita digitaalisen PCR:n uusiutumisen seurantatutkimuksiin. Hoidon valintaan liittyviin tutkimuksiin saatetaan suosia seuraavan sukupolven sekvensointimääritystä. Mihin tahansa nestebiopsiatutkimuksesi viekin, voimme auttaa sinua pääsemään sinne täydellisillä cfDNA-analyysiratkaisuilla, jotka ulottuvat muutamasta kohteesta usean geenin määrityksiin.
Toivottavasti annoimme sinulle ajateltavaa, kun harkitset soluvapaan DNA:n käyttöä laboratoriossasi. Mutta olen varma, että sinulla on joitakin kysymyksiä. Lähetä siis kysymyksesi osoitteessa thermofisher.com/ask ja tilaa kanavamme nähdäksesi lisää tällaisia videoita. Ja muista, että kun olet epävarma, tee Seq It Out!