Alun perin amplifioimaan yrittämistämme DNA-fragmenteista, vain tlp2, che1P ja cheA1 (taulukko 1) tuottivat PCR-monistustuotteen ilman liuotinlisäaineita, kun genomista DNA:ta A. brasilensen DNA:ta käytettiin templaattina (kuva 1). Ensin testattiin DMSO:n, jonka pitoisuudet olivat 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % ja 10 % (w/vol), sekä formamidin, jonka pitoisuudet olivat samankaltaisia, vaikutuksia PCR:n lisäaineina (kuva 1). PCR-sarja ajettiin myös BSA:n kanssa, jonka pitoisuus oli 1-10 μg/μl (tietoja ei ole esitetty). Kirjallisuudesta saatujen tietojen mukaisesti sekä DMSO:n että formamidin lisääminen PCR:ään lisäsi 2-3 kb:n suuruisten DNA-fragmenttien monistustulosta, mutta DMSO:n tehostava vaikutus oli suurempi kuin formamidin (kuva 1). Näissä olosuhteissa havaitsimme myös, että DMSO:n konsentraation lisääminen voi johtaa PCR-spesifisyyden heikkenemiseen (kuva 2). Toisaalta formamidin vaikutus PCR-tuoton lisääntymiseen väheni, kun DNA-fragmentit olivat suurempia kuin noin 2,5 kb (kuva 1). Pelkän BSA:n lisäämisellä PCR-lisäaineena ei näissä olosuhteissa ollut merkittävää vaikutusta, ei myöskään haitallista vaikutusta (tietoja ei ole esitetty). BSA:n PCR-tuottoa parantavia vaikutuksia havaittiin, kun sitä käytettiin yhdessä DMSO:n tai formamidin kanssa laajalla DNA-fragmenttien kokoalueella (kuva 2). Lisäksi BSA:n lisääminen laajensi konsentraatioaluetta, jolle orgaanista liuotinta voitiin lisätä, myös suurempikokoisille DNA-malleille (kuva 2). Formamidia koskevassa nykyisessä kirjallisuudessa vallitsee yksimielisyys siitä, että se on tehokkain PCR-lisäaine, kun sitä käytetään pitoisuuksina, jotka vaihtelevat 0-5 %:n välillä, ja sen teho laskee kokonaan 10 %:n kohdalla. Tuloksemme osoittavat, että BSA:n läsnä ollessa formamidi on tehokas ainakin 10 prosentin pitoisuuksiin asti ja enintään 2,5 kb:n kokoisilla DNA-malleilla (tlp2); se ei kuitenkaan edistänyt suuremman kokoisten DNA-fragmenttien monistumista (kuva 1). Tämä tulos on yhdenmukainen formamidin raportoidun vaikutuksen kanssa, jonka mukaan formamidi on tehokkain enintään noin 2,5 kb:n DNA-templaatin monistuksessa, ja tukee edelleen käsitystä siitä, että DMSO ja formamidi parantavat PCR:n tuottoa eri mekanismien avulla. Näistä eroista riippumatta BSA:n lisääminen tähän PCR:ään näytti edistävän ja laajentavan entisestään suotuisia vaikutuksia, joita havaittiin, kun jompaakumpaa näistä kahdesta liuottimesta käytettiin PCR-lisäaineena. Kun otetaan huomioon ne mahdolliset kielteiset vaikutukset, joita korkeilla orgaanisten liuottimien pitoisuuksilla voi olla herkille jatkojalostussovelluksille, kuten sekvensoinnille tai kloonaukselle, BSA:n lisäämisen tehostava vaikutus on merkittävä. Saadaksemme käsityksen siitä, miten BSA voisi toimia yhdessä DMSO:n tai formamidin kanssa tehostajana, analysoimme sen lisäämisen vaikutusta monistustulokseen 10, 15, 20, 25 ja 30 PCR-syklin aikana. Tämä analyysi vahvisti, että DMSO:n tai formamidin, mutta ei pelkän BSA:n, lisääminen PCR:ään johtaa saannon lisääntymiseen (kuva 3). Kun BSA:ta käytettiin tehostajana yhdessä DMSO:n tai formamidin kanssa, saannon lisäys voitiin havaita vain ensimmäisten 15 syklin aikana kaikkien templaattien osalta (kuva 3). Saannon lisäys vaihteli 10,5 prosentista (che1P) 22,7 prosenttiin (cheA1) ensimmäisten 15 syklin aikana. Lisäksi BSA:n tehokkaan konsentraation havaittiin kasvavan monistetun DNA-fragmentin koon myötä BSA:n maksimikonsentraatioon (10 μg/μl) asti, jolloin saannon lisäystä ei enää havaittu. Saannon ei myöskään havaittu vähenevän edes suurimmalla BSA:n pitoisuudella näissä olosuhteissa (kuva 4). BSA:n syklirajoitettu PCR-tuottoa parantava vaikutus viittaa siihen, että tämä proteiini saattaa ajan mittaan denaturoitua ja siten menettää tehoaan. Tämän hypoteesin testaamiseksi tehtiin PCR, jossa DMSO tai formamidi yhdistettiin BSA:han alkuperäisessä reaktiopuskurissa edellä määritellyillä tehokkaimmilla pitoisuuksilla, ja sitä ajettiin 10 sykliä ennen tuoreen BSA-liuoksen (0-10 μg/μl lopullinen pitoisuus) lisäämistä. BSA:n lisääminen toistettiin 30 PCR-syklin ajan ja vaikutus saantoon analysoitiin edellä kuvatulla tavalla. Saannon jatkuva kasvu voitiin havaita, kun BSA:ta lisättiin joka kymmenennessä PCR-syklissä: esimerkiksi cheA1:n monistuksessa PCR:n saanto kasvoi lähes 75 prosenttia verrattuna pelkällä liuottimella saatuun saantoon (kuva 4). Tulokset, jotka havaittiin menetelmässä, jota kutsumme ”BSA PCR-vaiheeksi”, ovat johdonmukaisia sen oletuksen kanssa, että BSA:n denaturoituminen aiheuttaa saantoa lisäävän vaikutuksen vähenemisen viidennentoista PCR-syklin jälkeen. Kontrollikokeet, joissa glyserolia tai tislattua steriiliä vettä lisättiin joka kymmenennellä syklillä, eivät lisänneet PCR:n saantoa, mikä osoittaa, että BSA:n vaikutukset eivät johdu reaktiotilavuuden muutoksesta tai siitä, että BSA toimii tehokkaasti molekyylitukkeutujana, mikä on ominaisuus, joka on liitetty joihinkin glyserolin vaikutuksiin PCR:ssä. Vaikka BSA:n PCR:n saantoa lisäävän vaikutuksen tarkkaa mekanismia ei tunneta, tässä saadut ja kirjallisuudessa kuvatut tiedot tukevat hypoteesia, jonka mukaan BSA saattaa vakauttaa DNA-polymeraasia ja/tai torjua orgaanisten liuottimien korkeiden pitoisuuksien mahdollisia inhiboivia vaikutuksia DNA-polymeraasin aktiivisuuteen. CheA4:n, tässä tutkimuksessa käytetyn DNA-fragmentin, jonka GC-pitoisuus oli korkein (73 %), monistamisessa PCR-tuotos kasvoi lisäämällä PCR:ään sekä BSA:ta että DMSO:ta, mutta myös useita epäspesifisiä monistustuotteita havaittiin (kuva 5). Tämän ongelman ratkaisemiseksi BSA:n PCR-vaiheen menetelmää käytettiin seuraavaksi yhdessä ”Touchdown”-PCR-protokollan kanssa, jonka on aiemmin osoitettu parantavan PCR-spesifisyyttä. Tämä menetelmä tuotti yhden spesifisen kaistan ja lähes kaksinkertaisti tuotoksen, joka saatiin käyttämällä Touchdown-protokollaa ja orgaanisia liuottimia yksinään (96 % lisäys) (kuva 5). Nämä tulokset ehdottivat meille myös keinoa parantaa QuickChange Stratagene Mutagenesis Kitissä (Stratagene) kuvatun koko plasmidin site-directed mutagenesis -menetelmän suhteellisen alhaista tehokkuutta mutaation aikaansaamiseksi johonkin GC-rikkaaseen DNA-mallineeseen (tässä tapauksessa tlp2-geeni, 2,5 kb:n pätkä, jonka GC-aste on 66 %). Kun käytimme pUCtlp2:ta templaattina paikkaohjattua mutageneesiä varten yhdessä mutageenisten alukkeiden kanssa, jotka oli suunniteltu tuomaan yhden emäsparin vaihto tlp2:n sisällä (mutageeniset alukkeet suunniteltu valmistajan verkkosivujen mukaisesti), ja valmistajan protokollaa noudattaen, pUCtlp2:ta vastaava 5,324 kb:n fragmentti oli hädin tuskin näkyvissä (kuva 5). Kun mutageeniprotokolla suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti, saatiin joko yhtään pesäkettä tai pieni määrä pesäkkeitä (keskimäärin alle 5), jotka sisälsivät emoplasmideja, joista puuttui haluttu mutaatio. Tämäntyyppinen tulos, jolle on ominaista mutageneesin heikko saanto, on aiemmin todettu tämän menetelmän yleiseksi sudenkuopaksi. Kun valmistajan puskuriin kuitenkin lisättiin BSA:ta viiden vaiheen välein, havaittiin selvästi monistumistuote (kuva 5). Kun valmistajan protokolla oli suoritettu loppuun, saatiin yli 100 pesäkettä, joista 2/3 kantoi haluttua mutaatiota (määritetty sekvensoimalla). Sovelsimme myös BSA-PCR-vaihetta päällekkäispidennysprotokollassa rakentaaksemme kimeerisen proteiinifuusion A. brasilense -geenin (ATM, 650 bp) ja syaanifluoresoivan proteiinin (CFP) (720 bp) välille. Päällekkäislaajennus-PCR:ssä käytetään ensin kahta alukeparia monistamaan kahta fuusioitavaa DNA-fragmenttia, joilla on lyhyt päällekkäinen sekvenssi keskenään. Kolmannessa monistuksessa käytetään ensimmäisten reaktioiden monistustuotteita templaatteina yhdessä uloimpien käänteis- ja etummaisten alukkeiden kanssa kimeeristen konstruktioiden tuottamiseksi. Kahden alkuperäisen DNA-fragmentin, ATM:n ja CFP:n, monistaminen oli erittäin tehokasta käyttämällä tavanomaisia PCR-protokollia, eikä merkittävää lisäystä saatu käyttämällä BSA PCR Step -protokollaa (tietoja ei ole esitetty). Toinen, päällekkäinen PCR-vaihe tuotti kuitenkin lukuisia epäspesifisiä monistustuotteita ja vain vähän, jos lainkaan, haluttua kimeeristä amplikonia (ATM-CFP; taulukko 1) (kuva 5). Epäspesifiset amplifikaatiotuotteet hävisivät, kun käytettiin ”Touchdown”-PCR-menetelmää, mutta spesifinen haluttu kimeerinen amplikoni säilyi hyvin vähäisenä, mikä havaittiin hyvin heikosta 1 370 bp:n ATM-CFP-kaistasta (kuva 5). Käyttämällä BSA PCR Step -menetelmää yhdessä ”Touchdown”-protokollan kanssa ATM-CFP-kimeerisen amplikonin saanto kasvoi 72 prosenttia (kuva 5). Myöhemmin suoritettu kloonaus ja sekvensointi vahvistivat, että on saatu oikea kimeerinen konstruktio.
DMSO:n ja formamidin vaikutus GC-rikkaiden templaattien PCR:n amplifiointiin. Tyypillisiä esimerkkejä DMSO:n ja formamidin lisäyksen vaikutuksista eri pitoisuuksina 2-3 kb:n GC-rikkaiden DNA-templaattien PCR-monistukseen. A) DMSO:n vaikutus che1P:n (ylhäällä) ja tlp2:n (alhaalla) PCR-monistumiseen, kuten havaittiin PCR:n kokonaistuotteiden geelielektroforeesissa. Geelit värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin. B) Formamidin vaikutus che1P:n (ylhäällä) ja tlp2:n (alhaalla) PCR-monistumiseen vertailukelpoisissa kokeissa.
PCR:n saantoa lisäävän vaikutuksen aikaansaaminen BSA:lla, kun BSA:ta on käytetty rinnakkaisliuottimena orgaanisten liuottimien kanssa. Tyypillisiä esimerkkejä BSA:n ja DMSO:n ja formamidin rinnakkaisadditiivina eri pitoisuuksina käytetyn BSA:n vaikutuksista GC-rikkaiden DNA-mallien PCR-monistukseen. A) DMSO:n vaikutus che1P:n PCR:ään (vasemmalla) ja DMSO:n ja 6 μg/μl BSA:n yhteisvaikutus (oikealla) PCR:n kokonaistuotteen geelielektroforeesissa havaittuna. B) Formamidin vaikutus che1P:n PCR-monistukseen (vasemmalla) ja formamidin ja 6 μg/μl BSA:n yhteisvaikutus (oikealla) vertailukelpoisissa kokeissa.
BSA:n lisäämisen vaikutus BSA:n lisäämiseksi rinnakkaisvahvistimena orgaanisten liuottimien kanssa PCR:n saantoon. PCR-tuoton lisäys on ilmaistu suhteessa PCR-tuottoon, joka on saatu ilman lisäainetta. Kaikissa paneeleissa on seuraava selitys: punainen viiva, vain DMSO (7,5 %); vihreä viiva, vain formamidi (2,5 %); violetti viiva, DMSO (7,5 %) ja BSA (6 μg/μl); vaaleansininen, formamidi (2,5 %) ja BSA (6 μg/μl). A) che1P:n PCR-monistus (392 bp); B) tlp5P:n PCR-monistus (798 bp); C) tlp2:n PCR-monistus (2638 bp); D) cheA1:n PCR-monistaminen (3 389 bp); E) cheOP1:n PCR-monistaminen (7 103 bp).
BSA:n vaikutus rinnakkaisadditiivina orgaanisten liuottimien kanssa silloin, kun BSA:ta on annettu lisäaineistuksena PCR:n välivaiheissa. A) BSA:n lisäyksen vaikutus PCR:n tuottoon, kun sitä lisätään kymmenen syklin välein laajalla kokovälillä (392 bp – 7 103 bp) oleville DNA-fragmenteille; B) Edustava esimerkki BSA:n lisäyksen vaikutuksesta cheA1:n (3 389 bp) PCR:n monistamiseen DMSO:n läsnäollessa, mikä havaittiin analysoimalla geelielektroforeesilla monistettuja DNA-fragmentteja.
BSA:n vaikutus rinnakkaislisäaineena orgaanisten liuottimien kanssa erilaisissa PCR-sovelluksissa. A) Edustava esimerkki BSA:n lisäyksen (BSA Step) vaikutuksesta DMSO:n yhteisvahvistajana cheA4:n PCR-monistukseen ”Touchdown”-PCR-protokollassa geelielektroforeesilla havaittuna. B) Edustava esimerkki BSA Step -protokollan vaikutuksesta pUCtlp2:n site-directed mutagenesis (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) PCR-monistukseen geelielektroforeesilla havaittuna. C) Edustava esimerkki BSA Step -protokollan vaikutuksesta, jota käytettiin päällekkäislaajennuksen PCR-sovelluksessa, jossa ATM fuusioitui CFP:n kanssa, jolloin saatiin ATM-CFP, geelielektroforeesilla havaittuna.