4.3. Nikotiinireseptorin rakenne
Sähköelinten ja selkärankaisten luurankolihasten nikotiinireseptori on pentameeri, joka koostuu neljästä erillisestä alayksiköstä (a, b, g ja d) stoikiometrisessä suhteessa 2:1:1:1. Kypsissä, hermotetuissa lihaksen päätelevyissä g-alayksikkö on korvattu e:llä, joka on läheisesti sukulainen alayksikkö. Yksittäiset alayksiköt ovat aminohapposekvensseiltään noin 40-prosenttisesti identtisiä, ja ne ovat peräisin yhteisestä alkuainegeenistä. Nikotiinireseptorista tuli prototyyppi muille pentameerisille ligandiohjatuille ionikanaville, joihin kuuluivat inhiboivien aminohappojen (g-aminovoihappo ja glysiini) ja tiettyjen serotoniinireseptorien (5-HT3) reseptorit. Kunkin pentameerisen reseptorin alayksikön molekyylimassa on 40 000-60 000 daltonia. Aminoterminaaliset 210 jäännöstä muodostavat käytännössä koko solunulkoisen domeenin. Tämän jälkeen seuraa neljä transmembraanin ylittävää (TM) domeenia; kolmannen ja neljännen domeenin välinen alue muodostaa suurimman osan sytoplasmakomponentista. Jokaisella nikotiinisen ACh-reseptorin alayksiköllä on solunulkoinen ja solunsisäinen altistus postsynaptisella kalvolla. Viisi alayksikköä on järjestetty pseudo-symmetria-akselin ympärille, ja ne ympäröivät sisäisesti sijaitsevaa kanavaa.
Reseptori on epäsymmetrinen molekyyli (14 nm × 8 nm), jonka daltonipitoisuus on 250 000 daltonia, ja suurin osa muusta kuin membraania ympäröivästä domeenista on solunulkoisella pinnalla. Liitosalueilla (eli luurankolihaksen motorisessa päätelevyssä ja sähköelimen ventraalisella pinnalla) reseptoria esiintyy suurina tiheyksinä (10 000/mm2) säännöllisessä pakkausjärjestyksessä. Tämä reseptorien järjestäytyminen on mahdollistanut sen molekyylirakenteen elektronimikroskooppisen kuvan rekonstruoinnin. Makean ja suolaisen veden etanoista on tunnistettu ACh:ta sitova proteiini, joka on homologinen vain nikotiinireseptorin solunulkoisen domeenin kanssa, ja se on karakterisoitu rakenteellisesti ja farmakologisesti.
Tämä proteiini rakentuu homomeeriseksi pentameeriksi ja sitoo nikotiinireseptorin ligandeja odotetulla selektiivisyydellä; sen kiderakenne paljastaa nikotiinireseptorilta odotettavissa olevan atomaarisen organisaation. Lisäksi ACh:ta sitovan proteiinin ja reseptorin transmembraanivälien fuusioinnilla saadaan toiminnallinen proteiini, jolla on reseptorilta odotetut kanavaportointi- ja tilamuutosominaisuudet. Tämä sitoutumisproteiini toimii sekä reseptorin rakenteellisena että toiminnallisena korvikkeena, ja sen avulla on saatu yksityiskohtainen käsitys nikotiinireseptorin ligandispesifisyyttä ohjaavista tekijöistä. Agonistien sitoutumiskohdat sijaitsevat alayksiköiden rajapinnoilla, mutta lihaksessa vain kaksi viidestä alayksikön rajapinnasta, a g ja a d, on kehittynyt sitomaan ligandeja. Agonistien, reversiibelien kilpailevien antagonistien ja elapid a-toksiinin sitoutuminen sulkee pois toisensa ja koskee reseptorin päällekkäisiä pintoja. Molemmat alayksiköiden rajapinnan muodostavat alayksiköt vaikuttavat osaltaan ligandispesifisyyteen. Kalvokonduktanssien mittaukset osoittavat, että ionien translokaationopeudet ovat riittävän nopeita (5 × 107 ionia sekunnissa), mikä edellyttää ionien translokaatiota pikemminkin avoimen kanavan kuin pyörivän ionikantajan kautta. Lisäksi agonistivälitteiset muutokset ionien läpäisevyydessä (tyypillisesti ensisijaisesti Na+:n ja toissijaisesti Ca2+:n siirtyminen sisäänpäin) tapahtuvat reseptorirakenteelle ominaisen kationikanavan kautta. Kunkin viiden alayksikön toinen transmembraanin ylittävä alue muodostaa kanavan sisäisen kehän. Agonistin sitoutumiskohta on läheisessä yhteydessä ionikanavaan; lihasreseptorissa kahden agonistimolekyylin samanaikainen sitoutuminen johtaa nopeaan konformaatiomuutokseen, joka avaa kanavan. Sekä sitoutumis- että porttivaste osoittavat positiivista yhteistoimintaa. Kanavan avautumisen kinetiikkaa koskevat yksityiskohdat ovat kehittyneet elektrofysiologisista patch-clamp-tekniikoista, jotka erottavat yksittäisen reseptorimolekyylin yksittäiset avautumis- ja sulkeutumistapahtumat, ja vahvistavat, että nikotiiniset asetyylikoliinireseptorit (nAChR) ovat pentameerisiä ligandigatoituneita ionikanavia, jotka koostuvat alayksiköistä, jotka koostuvat solunulkoisesta domeenista, joka kantaa ligandinsitomiskohtaa, ja erillisestä ioni huokoisesta domainista. Signaalinsiirto on seurausta näiden kahden domeenin välisestä allosterisesta kytkennästä, ja etäisyys sitoutumiskohdasta huokosdomeenin porttiin on 50 Å. Reseptorin sitoutumistutkimukset ovat kuitenkin spesifisiä nikotiinikolinergisille reseptoreille, jotka on tehty sammakoiden Rana catesbiana ja Rana temporaria eristetyissä vestibulaarisissa epiteeleissä. Esitetään todisteita nikotiinisen kaltaisten kolinergisten reseptorien läsnäolosta, jotka liittyvät erityisesti aistialueisiin, ja tutkitaan epätyypillisten nikotiinisten agonistien konformaatioiden sitoutumista, mikä antaa alatyypin selektiivisyyden, ja päädytään siihen, että nAChR:llä on ratkaiseva rooli eksitatorisessa neurotransmissiossa ja että se on tärkeä kohde lääkkeille ja hyönteismyrkyille. Erilaisia nAChR-alatyyppejä, joissa on erilaisia alayksikkökombinaatioita, jotka antavat erilaista selektiivisyyttä nikotiinilääkkeille, ja tunnistettiin myös geeniperhe, joka koodaa proteiineja, jotka ovat homologisia lihaksen nikotiinisen asetyylikoliinireseptorin α-alayksikön kanssa rotan genomissa. Nämä geenit transkriboituvat keskus- ja ääreishermostossa alueilla, joiden tiedetään sisältävän toimivia nikotiinireseptoreita. β2-pitoisten hermoston nikotiinireseptorien (nAChR) rooli nikotiinin haittavaikutusten välittäjänä sikiössä ja vastasyntyneessä. Raskaana oleviin WT- ja mutanttihiiriin, joilta puuttuu β2-nAChR-alayksikkö, istutettiin osmoottisia minipumppuja, jotka antoivat joko vettä tai kontrolloidun annoksen nikotiinia. Tämän jälkeen jälkeläisten sympathoadrenaalijärjestelmän ja hengitys- ja heräämisrefleksien kehittymistä verrattiin pian syntymän jälkeen, mikä on ajanjakso, jolloin alttius nikotiinialtistukselle on lisääntynyt. Toisaalta neonikotinoidit, kuten imidaklopridi, ovat nAChR-agonisteja, joilla on voimakas hyönteismyrkkyaktiivisuus. Imidaklopridista on tullut 1990-luvun alussa tapahtuneen käyttöönoton jälkeen yksi laajimmin käytetyistä hyönteismyrkyistä sekä kasvinsuojelu- että eläinten terveydenhoitosovelluksissa, imidaklopridiresistenssin molekyylinen perusta, viisi nAChR-alayksikköä (Nlα1-Nlα4 ja Nlβ1) on kloonattu Nilaparvata lugensista. Imidaklopridille herkkien ja imidaklopridille resistenttien populaatioiden nAChR-alayksiköiden geenien vertailussa on tunnistettu yksi pistemutaatio konservoituneessa kohdassa (Y151S) kahdessa nAChR-alayksikössä, Nlα1 ja Nlα3. Allelispesifisellä PCR:llä on osoitettu vahva korrelaatio Y151S-pistemutaation frekvenssin ja imidaklopridiresistenssin tason välillä. Nilaparvata lugens α- ja rotan β2-alayksiköitä sisältävien hybridi-nAChR:ien ilmentämisellä saatiin todisteita, jotka osoittavat, että mutaatio Y151S on vastuussa imidaklopridin spesifisen sitoutumisen huomattavasta vähenemisestä. Tässä tutkimuksessa annetaan suoraa näyttöä kohdekohtaisen resistenssin esiintymisestä neonikotinoidihyönteismyrkkyä vastaan, ja tutkittiin kationi-π-sitoutumiskohdan luonnetta nikotiinireseptorissa ja todettiin, että nikotiini-asetyylikoliinireseptori on prototyyppinen ligandi-portattu ionikanava. Useiden aromaattisten aminohappojen on todettu osallistuvan agonistin sitoutumiskohtaan, mikä viittaa siihen, että kationi-π-vuorovaikutukset voivat olla mukana agonistin, asetyylikoliinin, kvaternaarisen ammoniumryhmän sitoutumisessa. Kolinergisten molekyylien konformaatio nikotiinihermoreseptoreissa ja löytää korrelaation voimakkaiden nikotiinisten agonistien asetyylikoliinin, asetyyli-α-metyylikoliinin, laktoyylikoliinin, 1,1-dimetyyli-4-fenyylipiperatsiinin ja nikotiinin kiderakenneanalyyseistä, joiden avulla voidaan määrittää nikotiinihermoreseptoreiden kannalta merkityksellisten kolinergisten agonistien konformaatio. Kolmesta ihmisen glioomasolulinjasta eristettyjen mRNA:iden koodaamien välittäjäainereseptorien ilmentyminen. Oosyytit, joihin injektoitiin kahdesta glioblastoomasolulinjasta peräisin olevia mRNA:ita, eivät osoittaneet sähköisiä vasteita testatuille eri välittäjäaineille.
NAChR:n modulaatio strykniinillä havaitaan, että strykniini on voimakas ja selektiivinen glysiinireseptorien antagonisti, jonka havaittiin estävän lihasten (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ ja α 1β 1δ) ja hermosolujen (α 2β 2 ja α 2β 4) nikotiinisia asetyylikoliinireseptoreja (AcChoR), jotka ilmentyvät Xenopusin oosyyteissä. Pelkkä strykniini (enintään 500 µmol/l) ei saanut aikaan kalvovirtoja AcChoR:ia ilmentävissä oosyyteissä, mutta kun sitä annettiin ennen asetyylikoliinin (AcCho) superfuusiota, samanaikaisesti tai superfuusion aikana, se esti nopeasti ja palautuvasti AcCho:n aikaansaaman virran (AcCho-virta). NAChR:ia koodaavan eksogeenisen lähetti- RNA:n kääntäminen tuottaa toiminnallisia reseptoreita Xenopus-okosyyteissä, tässä tutkimuksessa Torpedon sähköisestä elimestä uutettu lähetti- RNA injektoitiin Xenopus-okosyyteihin. Tämä johti toiminnallisten asetyylikoliinireseptorien synteesiin ja sisällyttämiseen munasolun kalvoon. Kun asetyylikoliini aktivoi näitä Torpedon asetyylikoliinireseptoreita munasolun kalvolla, ne avasivat kanavia, joiden ionien läpäisevyys muistutti muiden solujen nikotiinireseptoreita.
Asetyylikoliinireseptorien (AChR) lokalisaatiota kanan alkion anteriorisen ja posteriorisen latissimus dorsi -lihaksen kehittyvien myogeenisten solujen pinnalla suhteessa innervaatioprosessiin on tutkittu ultrarakenteellisella tasolla piparjuuriperoksidaasi-α-bungarotoksiinikonjugaattia käyttäen. AChR:n paikallisia pitoisuuksia havaittiin pienillä alueilla 0,1-0.4 µm:n levyisiä alueita 10-14 päivän ikäisten lihasten myogeenisten solujen pinnalla, ja lisäksi on tutkittu asetyylikoliinin ja sen fysiologisia vaikutuksia jäljittelevien tai estävien aineiden vaikutuksia guanosiini 3′ -pitoisuuksiin:5′-syklisen monofosfaatin (syklisen GMP:n) ja adenosiini-3′:5′-syklisen monofosfaatin (syklisen AMP:n) pitoisuuksiin nisäkkäiden aivokuoren, sydämen kammion ja suolen viipaleissa. Asetyylikoliini ja kolinomimeettiset aineet, joilla on pääasiassa muskariinivaikutus, kuten metakoliini, beetaanikoli ja pilokarpiini, saivat aikaan syklisen GMP:n pitoisuuden nousun tai syklisen AMP:n pitoisuuden lievän laskun kaikissa kolmessa tutkitussa kudoksessa.
Hmisen hermoston α7 AcCho -reseptorin (α7 AcChoR) ja sen L248T-mutaatiomuodon (mut) toiminnallisia ominaisuuksia ja solulokalisoitumista tutkittiin ilmentämällä niitä yksinään tai geenifuusioina vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) tehostetun version kanssa. Xenopus-okosyytit, joihin oli injektoitu villityypin, mutα7:n tai kimeerisen alayksikön cDNA:ta, ekspressoivat reseptoreita, jotka aktivoivat kalvovirtoja, kun ne altistettiin AcCho:lle. Kuten jo tiedetään, wtα7-reseptorien synnyttämät AcCho-virrat häviävät paljon nopeammin kuin mutα7-reseptorien synnyttämät. β2-nikotiinireseptorien ja dopamiinireittien vuorovaikutus spontaanin liikkumisen valvonnassa ja toteaa, että asetyylikoliini (ACh) on tunnettu dopaminergisten (DAergisten) neuronien aktiivisuuden modulaattori nAChR:ien stimulaation kautta. DA-välitteiseen liikkumiseen osallistuvien nAChR:ien alayksikkökoostumus ja erityinen sijainti on kuitenkin vielä vahvistamatta in vivo. Hiirillä, joilta puuttuu nAChR:ien β2-alayksikkö (β2KO), esiintyy silmiinpistävää hyperaktiivisuutta avoimessa kentässä, mikä viittaa DA-neurotransmission epätasapainoon. Mutaatio nikotiinireseptorin domeenin M2 sisällä muuntaa kuitenkin 5-hydroksitryptamiinin antagonistista agonistiksi, tutkimus tehtiin 5-hydroksitryptamiinin (5HT) vaikutuksista homomeerisiin neuronaalisiin nikotiinireseptoreihin (nAcChoR), jotka on ilmaistu Xenopusin oosyyteissä sen jälkeen, kun villiintyneen kanan alayksikköä koodaava cDNA oli injektoitu. AcCho aiheutti suuria virtoja, joita 5HT vähensi palautuvalla ja annosriippuvaisella tavalla, puoli-inhibitorisella pitoisuudella ja Hillin kertoimella. Vaikka sytotoksisten T-lymfosyyttien kolinergisen reseptorin ja kolinergisten agonistien tutkiminen on herkistyneiden lymfosyyttien kykyä vahingoittaa herkistäviä alloantigeenejä kantavia soluja, hyökkäävän lymfosyyttipopulaation kolinergistä reseptoria on tutkittu farmakologisella manipuloinnilla in vitro -järjestelmässä, joka kvantifioi herkistyneiden hyökkäävien solujen kohdesoluille välittämää vahinkoa.