Abstract
Vuonna 1992 raportoimme uudesta menetelmästä, jolla voidaan sekvensoida proteiineja karboksiterminaalista (C-terminaali) (Boyd et al., 1992). Viimeisten kahden vuoden aikana olemme jatkaneet tutkimuksiamme, mukaan lukien C-terminaalin karboksyyliryhmän alkuperäisen aktivoinnin mekanismia ja aminohappojen reaktiivisten sivuketjujen tarkoituksellista muokkaamista sekvensointireagensseilla. Sekvensointiprotokollassamme käytettävien reagenssien ja reaktio-olosuhteiden valinnan ansiosta asparagiinihappo, glutamiinihappo, seriini ja treoniini johdetaan. Asparagiini- ja glutamiinihapon amidointi sekä seriinin ja treoniinin asetylointi ovat parantaneet saantoja näiden jäämien sekvensoinnissa. Aspartiini- ja glutamiinihappo luokitellaan nyt, kuten taulukosta 1 nähdään, helposti sekvensoitaviksi aminohappojäännöksiksi. Kriteerimme sen määrittämiseksi, kutsutaanko jäännös luotettavasti, on kyky sekvensoida ja havaita kyseinen jäännös, kun sitä on yhdessä nanomolissa proteiininäytettä. Keskimäärin on mahdollista sekvensoida 5 sykliä yhdestä nanomoolista proteiinia, joka on levitetty polyvinyylideenidifluoridi-membraanille (PVDF), jos aminohapposekvenssi sisältää ne jäännökset, jotka on lueteltu taulukon 1 sarakkeessa ”luotettavasti kutsuttu”. Vuoden 1994 MPSA-konferenssissa keskitymme havainnollistamaan tämän C-terminaalisen sekvensointimenetelmän nykyistä käyttökelpoisuutta PVDF:lle immobilisoitujen proteiinien sekvensoinnissa.