On laajalti hyväksytty, että luonnollisilla ja ravinnon antioksidanteilla on tärkeä rooli hapetusstressin aiheuttamien eri sairauksien ehkäisyssä. Hapettava stressi vaikuttaa sydän- ja verisuonisairauksien riskiin, mukaan lukien ateroskleroosi, pysäyttämällä vapaiden radikaalien tuotannon ja LDL:n hapettumisprosessin (Kovanen ja Pentikäinen, 2003). Reaktiiviset happilajit (ROS) johtavat hapettuneen LDL:n tuotantoon ja kertymiseen ateroskleroottisten leesioiden kohdalle (Yla-Herttuala, 1999). Oksidatiivinen stressi johtaa myös asteittain ateroskleroosin kehittymiseen edistämällä makrofagien vaahtosolujen muodostumista ja aiheuttamalla endoteelin toimintahäiriöitä (Mietus-Snyder ym., 2000). RS:n havaittiin vähentävän merkittävästi oksidatiivisen stressin merkkiaineita, kuten seerumin glykoitunutta albumiinia ja virtsan 8-hydroksiguanosiinia, aivohalvaukselle alttiilla, spontaanisti hypertensiivisillä rotilla (Mizutani ym., 2001). RS lisää myös katalaasin aktiivisuutta ja vähentää ROS-tuotantoa marsujen sydänkudoksessa (Floreani ym., 2003). Rocha ym. (2009) ovat osoittaneet hapettuneen LDL:n vähenevän runsasrasvaisella ruokavaliolla ruokituilla rotilla, joita hoidettiin RS:llä 45 päivän ajan annoksella 1 mg/kg päivässä. Kaikki edellä mainitut tulokset viittaavat siihen, että RS estää tehokkaasti lipidiperoksidaatiota in vivo. RS:n antioksidatiivisia ominaisuuksia ehdotettiin mekanismiksi, joka on sen moninaisten vaikutusten taustalla, mukaan lukien antiaterogeeniset vaikutukset (Fremont, 2000).
RS:n estävä vaikutus ROS-tuotantoon ja lipidiperoksidaatioon
Lukuisten tutkimusten mukaan RS estää oksidatiivista stressiä pelastamalla ROS:ia ja heikentämällä peroksyyliradikaaleja ja vetyperoksidia (Jang ja Surh, 2001; Liu ym, 2003; Shigematsu et al., 2003; Chen et al., 2004; Leiro et al., 2004). RS:n on osoitettu estävän sekä solunsisäistä että solunulkoista ROS-tuotantoa pitoisuuksilla, jotka vaihtelevat 1-100 μmol/l (Jang ja Surh, 2001). RS on osoittanut vahvoja antioksidanttisia ominaisuuksia vähentämällä sytokromi C:n hapettumisnopeutta hydroksyyliradikaaleilla, joita syntyy ultraviolettisäteilyllä vetyperoksidista (H2O2) (Turrens et al., 1997). RS:n on myös osoitettu syövyttävän hydroksyyliradikaaleja (Soares et al., 2003) ja estävän lipopolysakkaridien (LPS) tai forboliesterien stimuloimien makrofagien tuottamia superoksidiradikaaleja ja H2O2:ta. RS vähentää tehokkaasti LPS:n, forboliesterien tai superoksidi- tai H2O2-altistuksen aiheuttamaa 3H-arakidonihapon vapautumista (Martinez ja Moreno, 2000) ja alentaa merkittävästi tioliproteiinien pitoisuuksia ihmisistä eristetyissä verihiutaleissa (Olas ym., 2004). Leonard ym. (2003) ovat osoittaneet RS:n olevan vahva antioksidantti, joka puhdistaa hydroksyyli- ja superoksidiradikaaleja ja suojaa soluja estämällä lipidiperoksidaatiota solukalvoilla sekä DNA-vaurioita. RS:n on osoitettu estävän lipidiperoksidaatiota ja estävän hapettuneen LDL:n ottoa (Fremont ym., 1999; Leighton ym., 1999; Bhavnani ym., 2001). Tämä RS:n aiheuttama lipidiperoksidaation esto saattaa johtua RS:n vahvasta antioksidanttivaikutuksesta ja sen kyvystä estää ROS:n muodostumista (Fremont ym., 1999; Olas ja Wachowicz, 2002).
LDL-kolesterolin oksidoituminen on vahvasti yhteydessä sydän- ja verisuonitautien riskiin (Holvoet, 2004). Rotan maksan mikrosomeissa RS esti raudan aiheuttamaa sekä ultraviolettisäteilyn aiheuttamaa lipidiperoksidaatiota ja esti kuparin aiheuttamaa LDL:n hapettumista (Fauconneau ym., 1997; Miura ym., 2000). RS pystyi estämään tehokkaasti LDL:n oksidatiivista muuttumista estämällä lipoksigenaasientsyymin toimintaa (Maccarrone ym., 1999; Kovanen ja Pentikäinen, 2003). Punaviinin polyfenolien, RS mukaan luettuna, on raportoitu estävän LDL:n hapettumista; tämän vaikutuksen todettiin olevan voimakkaampi kuin tunnetun antioksidantin α-tokoferolin (Frankel ym., 1993). RS estää myös LDL:ssä esiintyvien monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista (Miller ja Rice-Evans, 1995) ja estää hapettuneen LDL:n imeytymistä verisuonten seinämään pitoisuudesta riippuvalla tavalla (Fremont, 2000) sekä ehkäisee peroksidaation aiheuttamia vaurioita lipideille (Frankel ja Waterhouse, 1993; Leighton ym., 1993), 1999).
RS hillitsee oksidatiivista stressiä lisäämällä typpioksidin synteesiä iskeemisissä uudelleenperfusoituneissa kudoksissa (Hattori ym., 2002). RS:n on osoitettu estävän LPS:n stimuloimaa ROS:n tuotantoa (Martinez ja Moreno, 2000) ja estävän tuumorinekroositekijän (TNF) indusoimaa ROS:n ja lipidiperoksidaatiota monenlaisissa soluissa, kuten myelooisissa, lymfaattisissa ja epiteelisoluissa (Manna ym., 2000). RS estää lipidiperoksidaatiota pesemällä tehokkaasti erilaisia vapaita radikaaleja, kuten peroksyyli- ja hydroksyyliradikaaleja, sydänlihaksen iskeemisen reperfuusion jälkeisessä sydänlihassa (Ray et al., 1999). RS-hoidon jälkeen havaittiin myös indusoituvan typpioksidisyntaasin estoa ja sytotoksisten vaikutusten ehkäisemistä (Tsai ym., 1999; Matsuda ym., 2000).
Bradamante ym. (2004) ovat selittäneet yksityiskohtaisesti RS:n vaikutusmekanismia lipidiperoksidaation estämisessä. On ehdotettu erilaisia mekanismeja, joiden kautta RS vaikuttaa antioksidanttisesti (Zini et al., 1999). Ensinnäkin RS saattaa kilpailla koentsyymi Q:n kanssa ja vähentää hapetusketjun kompleksi III:n toimintaa. Toiseksi RS:n on todettu lisäävän solunsisäistä vapaiden radikaalien pelastajaa glutationia, sillä RS ylläpitää solujen elinkelpoisuutta ja estää hapettumista (Savaskan ym., 2003). Kolmanneksi RS voi lisätä endogeenisia antioksidantteja ja vaiheen 2 entsyymejä kardiomyosyyteissä, ja nämä lisääntyneet solun puolustusmekanismit suojaavat hapettumisvaurioilta (Cao ja Li, 2004). RS ja sen analogit on osoitettu tehokkaiksi antioksidanteiksi linolihapon peroksidaatiota vastaan natriumdodekyylisulfaatti- ja setyylitrimetyyliammoniumbromidimikelleissä (Fang ym., 2002; Fang ja Zhou, 2008). Tulokset viittasivat siihen, että antioksidatiivisiin vaikutuksiin liittyy etenevien peroksyyliradikaalien vangitseminen mikkelin pinnalle ja α-tokoferolin regenerointi.
RS:n antioksidanttisten entsyymien modulaatio
RS-käsittelyn on todettu vähentävän oksidatiivista stressiä ja ehkäisevän erilaisia sairauksia lisäämällä useiden antioksidanttisten entsyymien, mukaan lukien superoksididismutaasin, katalaasin, glutationin, glutationireduktaasin, glutationiperoksidaasin ja glutationi-S-transferaasin, aktiivisuutta rotan aortan sileän lihaksen soluissa (Yen ym, 2003; Li et al., 2006). RS:n on osoitettu ylläpitävän glutationitasoja oksidatiivisesti stressaantuneissa ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisoluissa ja nostavan glutationitasoja ihmisen lymfosyyteissä, jotka on aktivoitu vetyperoksidilla (Losa, 2003; Olas et al., 2004). Vaiheen II lääkeaineita metaboloivien entsyymien ja antioksidanttigeenien voimakas annosriippuvainen induktio osoitettiin, kun rotille annettiin 0,3, 1 ja 3 g/kg ruumiinpainoa päivässä RS:ää 28 päivän ajan (Hebbar ym., 2005). Rocha ym. (2009) ovat osoittaneet, että RS-hoidon jälkeen oksidatiivinen stressi vähenee merkittävästi vähentämällä lipidihydroperoksidia ja lisäämällä antioksidanttisia entsyymejä, mukaan lukien superoksididismutaasi, runsaasti rasvaa sisältävällä ruokavaliolla ruokituilla rotilla.
RS:n anti-inflammatoriset vaikutukset
Tulehduksen merkitys ateroskleroosin syntyprosessissa on tunnustettu viime vuosikymmenen aikana yhä paremmin. Tulehduksella on merkittävä rooli ateroskleroosin kaikissa vaiheissa, mukaan lukien sen käynnistyminen, eteneminen ja plakin muodostuminen. (Libby ym., 2002; Jawien, 2008). Sekä in vivo että in vitro RS:n anti-inflammatorisia vaikutuksia ja niiden taustalla olevaa mekanismia on ehdotettu (Udenigwe et al., 2008). RS estää syklooksygenaasi-2:n aktiivisuutta, joka on entsyymi, joka tuottaa PGE2:ta, joka on elintärkeä komponentti tulehduksen välittämisessä (Donnelly et al., 2004). Interleukiini-6:n on todettu olevan tärkeä merkkiaine tulehdusprosessissa ja ateroskleroottisten plakkien etenemisessä (Ikeda ym., 2001). Viljeltyjen hiirimakrofagien on RS-hoidon jälkeen osoitettu vähentävän interleukiini-6:n geeniekspressiota, synteesiä ja eritystä (Zhong ym., 1999). RS:n havaittiin tukahduttavan tulehdusprosessia välittämällä erilaisia tulehdusmerkkiaineita, kuten interleukiini-8:n ja granulosyytti-makrofagikolonioita stimuloivien tekijöiden erittymisen estämistä (Culpitt ym., 2003; Donnelly ym, 2004), endoteelin ja leukosyyttien adheesiomolekyylejä, verisuonisolujen adheesiomolekyyli-1:tä sekä estämällä histamiinin ja tuumorinekroositekijä-α:n eritystä (Carluccio ym., 2003).
Vaskulaarisen endoteelin kasvutekijän aiheuttaman angiogeneesin estäminen näyttää tapahtuvan heikentämällä RS:llä ROS:stä riippuvaista reittiä ihmisen napalaskimon sisäsoluissa. (Lin et al., 2003). Rivera et al. (2009) osoittivat myös pro-inflammatorisen sytokiinin tuumorinekroositekijä-α:n vähenemistä sen jälkeen, kun Zucker-rotille oli annettu RS:ää annoksella 10 mg/kg ruumiinpainoa 8 viikon ajan. Pervaiz (2003) on osoittanut RS:n vaikutuksen ydintekijä-κB:n vaikutukseen, joka on tärkeä transkriptiotekijä, joka säätelee erilaisia tulehduksen välittäjiä, kuten sytokiineja, kasvutekijöitä ja adheesiomolekyylejä. RS:llä on voimakas anti-inflammatorinen vaikutus estämällä leukosyyttien adheesiota iskemian ja reperfuusion välisessä rottamallissa annoksella 0,7 mg/kg (Shigematsu ym., 2003).
Endoteelin toimintahäiriön on myös raportoitu olevan tärkeä riskitekijä sydän- ja verisuonitautien kehittymiselle (Rodriguez-Porcel ym., 2001). Fukuda ym. (2006) ovat havainneet, että RS lisää merkittävästi sydänlihaksen angiogeneesiä kokeellisen sydäninfarktin aiheuttamilla rotilla verisuonten endoteelin kasvutekijän välittämän mekanismin kautta. Saiko et al. (2008) tarkastelivat RS:n suotuisia vaikutuksia arakidonihappoaineenvaihduntaan, jossa todettiin, että RS estää fosfolipidien muuntumista arakidonihapoksi. Lisäksi RS hillitsee tulehdusta estämällä syklooksygenaasi-1, -2; lipoksygenaaseja, epoksygenaaseja sekä prostaglandiinien ja eikosanoidien synteesiä (Saiko ym., 2008). Hattori ym. (2002) ja Hung ym. (2000) osoittivat RS:n estävän tulehdusta ja ateromaattisten plakkien muodostumista muuttamalla typpioksidin tuotantoa verisuonten endoteelissä. RS moduloi tulehduksen välittäjäaineiden tuotantoa ja eritystä ja tukahduttaa siten polymorfonukleaaristen solujen trombogeenistä toimintaa (Rotondo ym., ), 1998).
RS:n rooli verisuonia laajentavien ja supistavien tekijöiden tuotannossa
Endoteelisolujen tiedetään säätelevän ja ylläpitävän tasapainoa verisuonia laajentavien tekijöiden, kuten typpioksidin, ja verisuonia supistavien tekijöiden, kuten endoteliini-1:n, välillä sekä pienentävän ateroskleroosin riskiä ehkäisemällä aterogeneesiä (Davignon ja Ganz, 2004). RS:n on raportoitu vaikuttavan vasodilataattorien ja vasokonstriktorien tuotannon väliseen tasapainoon ja ylläpitävän sitä (Fan ym., 2008). Typpioksidin tuotannon väheneminen johtaa vasokonstriktioon, verihiutaleiden aggregaatioon ja oksidatiiviseen stressiin. Lisäksi RS estää syklooksygenaasi-1-entsyymiä, joka on voimakas verisuonia supistava aine ja jolla on tärkeä rooli verihiutaleiden aggregaatiossa (Szewczuk ym., 2004). Typpioksidisyntaasin aktiivisuuden havaittiin lisääntyneen keuhkovaltimon endoteelisoluissa, kun niitä käsiteltiin RS:llä, mikä osoittaa typpioksidin suoran yhteyden vasorelaksaatioon (Klinge ym., 2003). RS:n on osoitettu lisäävän typpioksidisyntaasin ilmentymistä ja siten mahdollisesti suojaavan perfusoituja työsydämiä (Hattori ym., 2002), vaikkakaan RS:llä ei ollut tällaista suojaavaa vaikutusta typpioksidisyntaasin tyrmäyshiirillä (Imamura ym., 2002). Nämä tulokset vahvistavat RS:n vaikutuksen vasokonstriktorien ja vasodilataattoreiden tasapainottamisessa ja siten verihiutaleiden aggregaation ja oksidatiivisen stressin estämisessä, mikä johtaa CVD-riskin pienenemiseen.
Trombosyyttien aggregaation tukahduttaminen RS:llä
Trombosyyttien aggregaatiolla on tärkeä rooli ateroskleroosin välittäjänä, jolloin verihiutaleet tarttuvat solujen pintoihin, jolloin ne vapauttavat aivoverihiutaleiden kasvutekijää ja aiheuttavat ateroskleroosia. Tehostunut tai heikentynyt verihiutaleiden aggregaatio johtaa erilaisiin komplikaatioihin, kuten sydäninfarktiin, iskemiaan ja aivohalvaukseen. RS:n on kuitenkin osoitettu estävän verihiutaleiden aggregaatiota (Bertelli ym., 1996b; Bhat ym., 2001; Fan ym., 2008). RS:n aiheuttama verihiutaleiden aggregaation estäminen kaneilla, joille on annettu hyperkolesterolemista ruokavaliota, ja ateroskleroosin väheneminen geneettisesti hyperkolesterolemisilla hiirillä on myös osoitettu (Zini ym., 1999; Wang ym., 2002b). RS:llä ei kuitenkaan onnistuttu osoittamaan tällaisia vaikutuksia kokoveressä, koska mekanismi saattaa olla verihiutaleiden mitogeeni-aktivoitujen proteiinikinaasien estäminen (Kirk ym., 2000). RS:n eri vaikutusmekanismien on osoitettu estävän verihiutaleiden aggregaatiota, mukaan lukien verihiutaleiden tarttumisen estäminen tyypin I kollageeniin, joka on verihiutaleiden aktivoitumisen tärkein vaihe. Olas ja muut (2002) osoittivat, että verihiutaleiden esikäsittely RS:llä estää LPS:n tai trombiinin stimuloiman verihiutaleiden tarttumisen kollageeniin ja fibrinogeeniin. Nämä havainnot antavat lisätietoa RS:n estävästä vaikutuksesta verihiutaleiden aggregaatioon.
RS-hoidon turvallisuusnäkökohdat
Monissa ihmisillä ja erilaisilla eläinmalleilla tehdyissä tutkimuksissa on osoitettu, että RS:n lisäannostelun jälkeen ei ole ilmennyt merkittäviä myrkyllisiä vaikutuksia laajalla annosalueella. Rotilla ei havaittu myrkyllisiä vaikutuksia sen jälkeen, kun sille oli annettu suun kautta 20 mg/kg päivässä 28 päivän ajan (Juan et al., 2002). Näissä tutkimuksissa käytetyt annokset olivat tuhatkertaisesti suuremmat kuin yhden lasillisen punaviiniä päivässä juovan ihmisen nauttima määrä. Haitallisia vaikutuksia ei myöskään havaittu rotilla, jotka saivat RS-lisää 300 mg päivässä neljän viikon ajan (Crowell et al., 2004). Boocock et al. (2007) raportoivat, että ihmisillä ei ollut myrkyllisyyttä, kun RS:ää annettiin kerta-annoksena jopa 5 g. Näiden tutkimusten tulokset osoittavat, että RS:ää voitaisiin käyttää sen hyödyllisten vaikutusten vuoksi ilman ilmeistä myrkyllisyyttä.