Sienitautien torjunta-aine atsoksistrobiini edistää makean veden syanobakteerien ylivaltaa muuttamalla kilpailua

AZ:n myrkyllisyys viherleville ja syanobakteereille

Mallisyanobakteeri M. aeruginosa sekä yleistä viherlevää C. pyrenoidosa käytettiin tutkimaan AZ:n myrkyllisyyttä viherleviin ja syanobakteereihin. AZ:n eri pitoisuudet eivät tukahduttaneet M. aeruginosan kasvua 7 päivän käsittelyn aikana (kuva 1a), kun taas C. pyrenoidosan kasvu estyi noin 9,2-30 % kolmella testatulla AZ-pitoisuudella 7 päivän jälkeen (kuva 1a). C. pyrenoidosan kasvu matalan AZ-pitoisuuden (5-10 μg L-1) läsnä ollessa ja alhaisella leväsolujen alkutiheydellä (noin 20 000 solua/ml, joka on lähellä luonnossa esiintyvää levätiheyttä), jotka ovat luonnollisesti saastuneita ympäristöjä edustavia olosuhteita, estyi merkittävästi 20~30 %:lla (lisätiedosto 1: kuva S2) (p < 0,05), kun taas M. aeruginosan kasvuun ei ollut vaikutusta samoilla testatuilla AZ-pitoisuuksilla. Aiemmat laboratoriotutkimukset osoittivat myös, että AZ:n estävät myrkylliset vaikutukset vaihtelivat dramaattisesti viherlevien ja syanobakteerien välillä; esimerkiksi liuenneen AZ:n myrkyllisyys klorofyytti Pseudokirchneriella subcapitatan kasvuun oli lähes 500-kertainen syanobakteeri Anabaena flos-aquae -bakteeriin verrattuna.

Mikrokosmoksen avulla tutkittiin AZ:n vaikutuksia planktonyhteisöön. Mikro-organismit erotettiin luonnollisesta järvivedestä suodattamalla ja siirrettiin keinotekoiseen väliaineeseen, minkä jälkeen mikrokosmoksiin lisättiin erilaisia AZ-pitoisuuksia. Chl-a:n ja fykosyaniinin pitoisuudet mitattiin mikrokosmoksissa AZ-käsittelyn jälkeen. Chl-a-pitoisuus, joka arvioi kasviplanktonin kokonaisbiomassaa , saavutti 4 mg L-1 kontrollimikrokosmoksissa kolmen päivän kasvatuksen jälkeen väliaineessa, ja kasviplanktonin kukinta alkoi (kuva 1b). Altistaminen AZ-pitoisuudelle, joka oli korkeampi tai yhtä suuri kuin pienin testattu pitoisuus (0,5 mg L-1) kolmen päivän ajan, vähensi Chl-a-pitoisuutta, mikä osoittaa, että AZ:lla voi olla myrkyllisiä vaikutuksia viherlevien muodostamiin kasviplanktonpopulaatioihin (kuva 1b). Chl-a-pitoisuus väheni 8,7-37,3 prosenttia mikrokosmoksissa testatuilla AZ-pitoisuuksilla. Sitä vastoin toisen pigmentin, fykosyaniinin, jota käytettiin syanobakteerien biomassan vertailuarvona, tuotanto lisääntyi kolmen päivän altistuksen jälkeen AZ:n pitoisuuksilla, jotka olivat vähintään 2,5 mg L-1 (kuva 1). 1c), mikä viittaa siihen, että AZ suosi syanobakteerien kasvua mikrokosmoksessa.

Atsoksistrobiinin hajoamisnopeutta vesiympäristössä kiihdyttää valo, ja AZ:n vesifotolyysi DT50 (aika 50 %:n hajoamiseen) (pH 7) on 8,7-13,9 päivää . Mielenkiintoista on, että liuenneen AZ:n pitoisuudet pienenivät eri tavoin ajan mittaan viherlevä- ja syanobakteeriviljelmien vaikutuksesta; ne pienenivät nopeammin C. pyrenoidosa- kuin M. aeruginosa -viljelmissä (kuva 1d). Tämä osoitti, että eukaryoottinen levä C. pyrenoidosa otti enemmän liuennutta AZ:tä kuin M. aeruginosa, vaikka ne oli istutettu samaan optiseen tiheyteen. Liuenneen AZ:n pitoisuuden ehtyminen mikrokosmoksissa oli myös nopeampaa kuin M. aeruginosa -viljelmissä (kuva 1d). AZ:n ehtyminen mikrokosmoksissa voitaisiin selittää AZ:n ensisijaisella imeytymisellä/adsorptiolla viherleviin (mikrokosmosten pääkomponentti) sekä AZ:n suuremmalla adsorptiolla muihin vesieliöihin kuin syanobakteereihin. Edellä mainitut tulokset viittaavat siihen, että C. pyrenoidosa oli paljon herkempi AZ:lle kuin M. aeruginosa, mikä johtui todennäköisesti osittain C. pyrenoidosan suuremmasta AZ:n kulutuksesta (imeytymisestä/adsorptiosta).

Transkriptioiden osuuksien vaihtelu AZ-altistuksen jälkeen koko planktonyhteisössä

Meta-transkriptominen sekvensointi suoritettiin, jotta voitiin tutkia transkriptioiden muutoksia koko planktonyhteisön transkriptioissa AZ-altistuksen jälkeen. Yhteenveto meta-transkriptomisen sekvensoinnin tuloksista on esitetty lisätiedostossa 1: Laajennetut tulokset. Transkriptien taksonomiset osuudet kahdessa ryhmässä eri taksonomisilla tasoilla esitetään lisätiedostossa 2: Dataset 2, joita edustaa taksonomisesti annotoitujen transkriptien suhteellinen runsaus (RAT). RAT-arvo ei edusta mikrobibiomassaa, vaan pikemminkin transkriptioaktiivisuuden muutoksia lajien välillä, mikä edustaa mikrobiyhteisön aktiivisia aineenvaihduntatiloja ja toimintoja.

RAT:ien suhteellista runsautta kontrollimikrokosmoksissa 7 päivän viljelyn jälkeen hallitsi pääasiassa Monoraphidium sp. (Chlorophyta-suku) (Kuva 2). Chlorophyta-suvun RAT:n suhteellinen runsaus laski kuitenkin 63,6 prosentista kontrollissa 35,8 prosenttiin AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa (kuva 2a, lisätiedosto 1: taulukko S2), vaikka AZ-käsittely ei vaikuttanut juurikaan Chlorophyta-suvun sisällä olevien pääluokkien taksonomisten transkriptien määriin (kuva 2c). Muiden eukaryoottisten levälajien RAT:ien suhteellinen runsaus Phaeophyceae- ja Eustigmatophyceae-heimon joukossa väheni myös merkittävästi AZ:llä käsitellyissä mikrokosmoksissa (p < 0,05), kun taas Bacillariophyta-heimon runsaus kasvoi ~ 6-kertaiseksi (lisätiedosto 1: taulukko S2). Samaan aikaan syanobakteerien (pääasiassa Synechococcales) RAT kasvoi dramaattisesti yli 20-kertaiseksi eli 1,7 prosentista kontrolliryhmässä 38,3 prosenttiin AZ-ryhmässä. Eukaryota/prokaryota-sekvenssirunsaussuhde laski 3,1:stä 0,9:ään (kuva 2b) AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa, mikä johtui pääasiassa syanobakteerien jyrkästä lisääntymisestä ja klorofytojen vähenemisestä. Syanobakteerien lisääntyminen AZ:llä käsitellyissä mikrokosmoksissa liittyi Synechococcales-luokkien osuuden kasvuun ja Chroococcales-luokkien osuuden pienenemiseen (kuva 2d), kun taas AZ ei vaikuttanut eukaryoottisten pääluokkien, Chlorophyta-luokkien, suhteelliseen runsauteen (kuva 2c). Syanobakteerit järjestyksessä Synechococcale voivat muodostaa myrkyllisiä kukintoja, jotka mahdollisesti vaikuttavat eukaryoottisiin leväkilpailijoihin .

AZ inhiboi sekä Monoraphidium sp.:n että Synechococcus sp.:n toimintaa monokulttuureissa

Mikäli Monoraphidium sp.:n RAT puolittui ja synechococcus sp.:n RAT puolittui. kasvoi jyrkästi AZ-käsittelyn jälkeen, tehtiin AZ:n myrkyllisyysbiomäärityksiä Synechococcus sp.:n ja Monoraphidium sp.:n laboratorioeräkasvattamoissa vahvistaaksemme hypoteesiamme, jonka mukaan AZ:n lisääminen mikrokosmoksissa voisi suosia syanobakteeria (Synechococcus sp.) viherleväkilpailijan (Monoraphidium sp.) kustannuksella. Mielenkiintoista oli, että Synechococcus sp. -monokulttuurien kasvu BG-11-mediassa estyi ~ 28 %:lla 7 päivän jälkeen (kuva 3a) (p < 0,05) AZ:n alkupitoisuudella 2,5 mg L-1, vaikka se ei vaikuttanut merkittävästi 4 päivän altistumisen jälkeen (p = 0,21), mikä osoittaa, että pitkäaikainen altistuminen korkeille AZ:n pitoisuuksille voi estää Synechococcus sp. -kasvua. Sitä vastoin Monoraphidium-lajin kasvu laboratorion yksileväviljelmissä estyi aina koko kasvatusprosessin ajan; solutuotos estyi ~ 45 % 7 päivän altistumisen jälkeen 2,5 mg L-1 AZ:lle (alkuperäinen pitoisuus) (kuva 3b). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että Monoraphidium sp. on herkempi AZ:lle kuin Synechococcus sp. Synechococcus sp.:n huomattavan kasvuedun vuoksi AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa (Kuva 3). 2d), näyttää siltä, että AZ:llä on epäsuora rooli Synechococcus sp:n hyötymisessä.

AZ estää Monoraphidium sp. ja hyödyttää Synechococcus sp. -lajia yhteiskulttuureissa

Kahden levälajin yhteiskasvatuksessa havaittiin, että AZ:n lisääminen hyödyttää Synechococcus sp. Monoraphidium sp.:tä enemmän sekä suodatetussa eutrofisessa järvivedessä (Kuva 3c-f) että modifioidussa BG-11-alustassa (Lisätiedosto 1: Kuva S3), mikä oli sopusoinnussa meta-transkriptomianalyysin RAT-tulosten kanssa. Seitsemän päivän viljelyn jälkeen eutrofisessa järvivedessä AZ-käsittely paransi solujen lukumäärän suhdetta (Synechococcus/Monoraphidium) 1,2:sta kontrollissa 2,3:een, 3,6:een tai 7,7:ään käsiteltäessä 25 μg L-1:llä, 250 μg L-1:llä tai 2,5 mg L-1:llä AZ:llä (Kuva 3c-f). Prokaryoottisten ja eukaryoottisten levien kasvun tulokset modifioidussa BG-11-väliaineessa (lisätiedosto 1: kuva S3) olivat samankaltaisia kuin eutrofisessa järvivedessä, jossa Synechococcus sp. sai hallitsevan aseman AZ-käsittelyssä. Luonnonvesissä viherlevien ja syanobakteerien välillä vallitsee tasapaino, jota ohjaavat useat tekijät, kuten allelopaattiset vuorovaikutukset ja positiivinen palaute. AZ:n läsnäolo häiritsi tätä tasapainoa todennäköisesti muuttamalla viherlevien aineenvaihduntaa ja stimuloi Synechococcus sp.:n kasvua suhteessa Monoraphidium sp.:n kasvuun yhteiskulttuureissa (kuvat 3c-f). AZ-käsittelyn jälkeen Synechococcus sp:n solumäärä kasvoi ~ 1,5-kertaiseksi yhteiskulttuurissa (Kuva 3c-f), kun taas Synechococcus sp:n RAT kasvoi yli 20-kertaiseksi mikrokosmoksessa kontrolliin verrattuna. Koska RAT:ia ei voida helposti verrata solutiheyteen, on vaikea verrata kvantitatiivisesti laboratorio- ja mikrokosmoksen kokeita. Molemmat kokeet viittaavat kuitenkin siihen, että AZ edistää syanobakteerien kasvua muuttamalla kilpailua viherlevien kanssa.

AZ muuttaa sienten, virusten, bakteerien ja eläinplanktonin transkriptionaalista aktiivisuutta

Sienten, mukaan lukien Zygomycota-, Basidiomycota-, Chytridiomycota- ja Ascomycota-sienet, RAT-arvot laskivat merkitsevästi (p < 0,05) AZ:lle altistumisen jälkeen kontrolliin verrattuna (Lisätiedosto 1: Taulukko S2) AZ:n fungisidisen vaikutuksen vuoksi. On syytä huomata, että myös heimon Chlorobi, johon kuuluvat fotosynteettiset bakteerit, jotka eivät tuota happea ja suosivat anaerobisia ympäristöjä, RAT kasvoi merkittävästi (~ 8-kertaiseksi) (p < 0,05) AZ:llä käsitellyissä mikrokosmoksissa. Vaikka liuenneen hapen kokonaispitoisuus (DO) pysyi AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa ylikyllästyneenä kontrolliin verrattuna (Lisätiedosto 1: Kuva S4), AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa saattaa olla hyvin kehittyneitä anoksisia mikrovyöhykkeitä, jotka ympäröivät mikrobiologisia (ehkä syanobakteeri-) aggregaatteja, mikä olisi sopusoinnussa Chlorobin RAT:n kasvun kanssa. Useimpien heimojen, kuten Arthropoda-, Nematoda- ja Cnidaria-sukujen, eläinplanktonin RAT pieneni AZ-altistuksessa kontrolliin verrattuna (lisätiedosto 1: taulukko S2), kun taas joidenkin sukujen, kuten Acanthamoeba-suvun, RAT oli päinvastainen (taulukko 1). Yleisesti ottaen joidenkin eläinplanktonin (kuten Daphnia, Arthropoda), sienten (jotka kuuluvat Chytridiomycota-sukuun), heterotrofisten bakteerien (Cytophaga ja Bdellovibrio) ja virusten (Podoviridae, Siphoviridae ja Myoviridae) RAT-arvot pienenivät merkitsevästi AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa verrattuna kontrolliin (taulukko 1, kuva 4). Edellä mainitut planktoniset organismit voivat laiduntaa, loistaa tai lyysiä syanobakteereja ja vaikuttaa niiden runsauden säätelyyn, mikä saattaa selittää osittain syanobakteerien hallitsevuuden AZ:n läsnä ollessa. Toinen mahdollisuus eläinplanktonin suhteellisen runsauden vähenemiselle on, että nämä muutokset saattavat heijastaa syötävien klorofyyttien vähenemistä ja syömäkelvottomien syanobakteerien lisääntymistä, sillä klorofyytit ovat herkempiä AZ:lle kuin syanobakteerit.

Tiedetään myös, että sieni-zoosporilla on kriittinen rooli syömäkelvottomien syanobakteerien ja eläinplanktonin välisessä yhteydessä. Niveljalkaiset (cladocerans tai copepodat) eivät kykene syntetisoimaan de novo -steroleja, vaan niiden on löydettävä niitä ravinnostaan. Esimerkiksi sytridien zoosporat ovat olennainen ravintolisä Daphnioille, kun ne laiduntavat filamenttisia syanobakteereja. Koska sienitautien torjunta-aine AZ esti voimakkaasti sieniä ja siten todennäköisesti vähensi sienien zoosporien määrää (taulukko 1), on mahdollista, että Daphnia-lajin laiduntaminen syanobakteereilla vähenee, mikä puolestaan vähentäisi Daphnia-lajin kasvua (taulukko 1) ja lisäisi syanobakteerien kasvua, mikä suojaisi syanobakteereja laiduntamiselta. Eläinplanktonyhteisö tai syanobakteerien virukset ja loiset eivät todennäköisesti kontrolloineet syanobakteerikukintaa. Ne voivat kuitenkin lisätä vesijärjestelmän vakautta muuttamalla ravintoverkon rakennetta ja voivat vaikuttaa mikrobiyhteisöön sekä mahdollisesti edistää syanobakteerikukintaa.

Metaboliset reitit eukaryotissa ja bakteereissa vasteena AZ-käsittelylle

Koska yleinen transkriptominen annotointitieto on vähäistä Chlorella-suvun ja muiden klorofyyttien osalta , koko mikrobiyhteisön meta-transkriptomianalyysit olivat avuksi, jotta planktonisten eliöiden ja syanobakteerien välisiä vuorovaikutussuhteita voitiin ymmärtää paremmin. Yhteenveto funktionaalisesta annotaatiosta on lisätiedostossa 1: Laajennetut tulokset, ja yksityiskohtainen funktionaalinen vaihtelu on lisätiedostossa 2: Dataset 3, 4. Erottelimme eukaryota- ja bakteerisekvenssit ja purimme ne KEGG-tasolla 3 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Kuvassa 5 on esitetty 40 tärkeintä polkua, jotka perustuvat transkriptien (jotka kuuluvat edellisessä jaksossa mainittuihin neljään aineenvaihduntajärjestelmään) suhteelliseen runsauteen eukaryota- ja bakteeriryhmissä.

Vaikka AZ ei vaikuttanut voimakkaasti eukaryota-aineksen koostumusosuuteen (lisätiedosto 1: kuva S5a), se vaikutti usein tuntuvasti KEGG-tason 3 kulkureitteihin (lisätiedosto 2: dataset 4). Kuten kuvasta 5a käy ilmi, voimakkaimmin yli-ilmentyneitä polkuja AZ:n läsnäolon vuoksi eukaryotassa olivat kasvihormonien signaalinsiirto, MAPK-signalointireitti, typpiaineenvaihdunta, ubikitiinivälitteinen proteolyysi ja glyserofosfolipidien aineenvaihdunta, ja ali-ilmentyneimpiä polkuja olivat porfyriini- ja klorofylli-aineenvaihdunta, oksidatiivinen fosforylaatio ja peroksisomeja koskeva aineenvaihdunta, mikä osoittaa AZ:n moduloivan funktionaalista geenien ilmentymistä eukaryotassa.

Vasteena syanobakteerikukinnalle bakteeriyhteisön rakenne ja aineenvaihduntateiden suhteellinen runsaus muuttuivat dramaattisesti (Kuva 5b ja Additional file 1: Figure S5b). Kuten kuvasta 5b käy ilmi, syanobakteereihin läheisesti liittyvät polut yli-ilmentyivät merkitsevästi (p < 0,05), mukaan lukien karotenoidien biosynteesi (+ 1326 % kontrolliin verrattuna), fotosynteesi-antenniproteiinit (+ 1305 %) ja fotosynteesi (+ 758 %). Huomasimme myös, että monet polut, joiden suhteellinen runsaus oli alhainen (< 0,05) ja jotka liittyivät antibioosiin, vitamiinien aineenvaihduntaan ja polysakkaridien synteesiin, ilmentyivät eri tavoin AZ:n vaikutuksesta (lisätiedosto 2: Dataset 4). Näitä toimintoja käsitellään jäljempänä.

1. Oksidatiivisen fosforylaation ja fotosynteesin modulointi AZ:n avulla. Sekä eukaryoottien että prokaryoottien oksidatiiviseen fosforylaatioon liittyvien geenien suhteellinen ilmentymistaso laski dramaattisesti AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa, ja eston aste oli molemmissa valtakunnissa vastaava, eli ~ 42 % kontrolliin verrattuna. Geenit (atpA, atpB, atpD ja atpF), jotka koodaavat F-ATPaasi-entsyymiä mitokondrioiden ja kloroplastien kalvoissa, ekspressoituivat merkitsevästi aliekspressoituneina sekä eukaryooseissa että bakteereissa (vähenivät noin 40~80 %) (p < 0,05). Tämä F-ATPaasin transkription väheneminen voitaisiin selittää AZ:n myrkyllisellä vaikutuksella, joka estää sytokromi b:n ja sytokromi c1:n välisen elektroninsiirtokompleksin, mikä vähentää mitokondrioiden hengitystä ja ATP-tuotantoa . Fotosynteettisten aineenvaihduntareittien osalta fotosysteemien transkriptien modulaatio AZ-käsittelyn jälkeen oli erilaista eukaryoottien ja bakteerien välillä (lisätiedosto 1: kuva S6). Bakteereissa fykobilisomiin osallistuvat geenit (esim. apcD, apcE, cpeC, cpeZ) yli-ilmentyivät voimakkaasti (noin 4-32-kertaisesti), kun taas eukaryotassa valonkorjuukompleksin proteiineja koodaavien geenien (esim. LHCB2 ja LHCA1) transkriptio säilyi enimmäkseen muuttumattomana (Lisätiedosto 2: Dataset 5). Tämä on linjassa syanobakteerien lisääntymisen kanssa AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa. On kuitenkin syytä huomata, että bakteereilla voi olla AZ:n detoksifikaatiomekanismeja AZ:n myrkyllisyyden vähentämiseksi lisäämällä voimakkaasti (noin 10-24-kertaisesti) NAD(P)H-kinonioksidoreduktaasigeenejä (ndhD, ndhF, ndhH), jotka koodaavat entsyymiä, jotka suojaavat soluja AZ:n läsnäollessa mahdollisesti esiintyvältä ympäristöstressiltä. Lisäksi prokaryootit voivat detoksifioida reaktiivisia happilajeja lisääntyneen karotenoidien biosynteesin (+ 1326 %) ja glutationimetabolian (+ 344 %) kautta ja parantaa solujen korjausta (mismatch repair -geenit, + 211 %) .

2. Polysakkaridien synteesi ja hajoaminen. Useiden eukaryoottien polysakkaridien biosynteesiin liittyvien geenien transkriptio lisääntyi (lisätiedosto 1: taulukko S3), esimerkiksi lipopolysakkaridien biosynteesireittien geenit (+353 %). Sekä AZ- että kontrolliryhmässä yli-ilmentyi myös polysakkarideihin liittyvä järjestelmä (ABC-transportteri, +162 %), jonka on osoitettu vievän polysakkarideja solujen ulkopuolelle. Kasviplanktonin lisääntyneen polysakkaridisynteesin on raportoitu lisääntyneen stressaavissa ympäristöissä. Sitä vastoin bakteereissa neljä glykaanisynteesiin liittyvää reittiä (N-glykaanin biosynteesi, erityyppiset N-glykaanin biosynteesit, lipopolysakkaridien biosynteesi ja peptidoglykaanien biosynteesi) aliekspressoitui (noin 63~77 %) merkittävästi (p < 0,05), mutta reitti ”muu glykaanien hajoaminen” yliekspressoitui noin 10-kertaisesti AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa kontrolliin verrattuna. Jos oletetaan, että yleistetty ennustettu polysakkaridien synteesin väheneminen prokaryooteissa tapahtui syanobakteereissa, oletettu polysakkaridien painolastin väheneminen syanobakteereissa voisi auttaa ylläpitämään syanobakteereja järven pinnalla ja auttamaan valon hyödyntämisessä, joka heikkenee voimakkaasti syvyyden myötä kukinnan aikana. Useiden syanobakteerien, mukaan lukien Synecocchococus-suvun syanobakteerit, on todellakin osoitettu muokkaavan kelluvuutta polysakkaridisynteesin avulla.

3. Vitamiinien biosynteesin modulaatio ja mahdolliset vuorovaikutukset bakteerien ja eukaryoottien välillä. Eukaryooteissa kaikki B-vitamiinien biosynteesiin liittyvät polut (esim. tiamiini, riboflaviini, niasiiniamidi, pantotenaatti, B6-vitamiini, biotiini, lipoiinihappo ja folaatti) yli-ilmentyivät (14~243 %) AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa kontrolliin verrattuna (lisätiedosto 1: taulukko S4). Sitä vastoin bakteereissa folaatin, nikotiiniamidin ja tiamiinin biosynteesiin liittyvät biokemialliset reitit yli-ilmentyivät (37~139 %) AZ-altistuksen jälkeen mikrokosmoksissa, kun taas vitamiinien biosynteettiset reitit olivat pienemmällä suhteellisella runsaudella (ts, biotiini ja lipoiinihappo, riboflaviini, B6) aliekspressoitiin merkittävästi (22~68 %, p < 0,05) AZ-käsitellyissä mikrokosmoksissa kontrolliin verrattuna (lisätiedosto 1: taulukko S4). Mielenkiintoista oli, että bakteereissa kahden B12-vitamiinin (kobalamiini) kuljetukseen osallistuvan geenin (btuB tai K16092: B12-vitamiinin kuljettaja ja btuF tai K06858: B12-vitamiinin kuljetusjärjestelmän substraattia sitova proteiini) suhteellinen runsaus väheni 88 % ja 57 % AZ:lla käsitellyissä mikrokosmoksissa suhteessa kontrolliin (ks. lisätietoja tiedosto 2: Dataset 5). Koska useat eukaryoottilajit (mukaan lukien sienet ja monet klorofyytit) eivät pysty syntetisoimaan kobalamiinia de novo ja ovat riippuvaisia mutualistisista bakteereista tämän vitamiinin hankkimiseksi, tuloksemme tukevat hypoteesia, jonka mukaan syanobakteerien lisääntyminen AZ:n läsnä ollessa voi ainakin osittain selittyä B12-vitamiinin mutualistisen vaihdon vähenemisellä bakteerien ja eukaryoottien välillä.

AZ muutti sienien, eukaryoottisten levien ja syanobakteerien välisiä vuorovaikutuksia

Tuloksemme ovat johdonmukaisia sienien tai eukaryoottien ja prokaryoottien välisten allelopaattisten vuorovaikutusten kanssa, millä on potentiaalisia vaikutuksia syanobakteerikukintojen dynamiikkaan. Ensinnäkin raportoimamme monien sienten, jotka tuottavat useita sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita, jotka edistävät syanobakteerien solujen lyysiä, suhteellisen aktiivisuuden väheneminen voi auttaa suosimaan syanobakteereja. Toiseksi kaksi eukaryoottista antibioottien biosynteesireittiä (monobaktaamien biosynteesi (+ 1524 %) ja penisilliinin ja kefalosporiinien biosynteesi (+ 161 %)) ilmentyivät 1,6-15-kertaisesti AZ-altistuksessa. Tämä viittaa siihen, että eukaryoottiset mikro-organismit voisivat reagoida syanobakteerien lisääntymiseen tuottamalla antibakteerisia yhdisteitä, vaikka on epätodennäköistä, että tämä estäisi syanobakteerikukintojen puhkeamisen. Kolmanneksi, kuten lisätiedostossa 1: Kuva S7, syanobakteerien suhteellinen runsaus bakteeriyhteisössä oli 39,3 % Taihu-järven näytteenottopaikassamme (johdettu 16S rRNA-geenin sekvensointitiedoista), kun taas syanobakteerien suhteellinen runsaus bakteereissa 7 d:n viljelyn jälkeen kontrolli- ja AZ-käsitellyissä ryhmissä oli 7,1 % ja 72,1 %. Se osoitti, että viherlevien suuri osuus (kuva 3c) saattoi rajoittaa syanobakteerien aktiivisuutta jopa eutrofisissa olosuhteissa.

Lyhytaikaisen AZ-kontaminaation pitkäaikainen mahdollinen vaikutus

Kuten lisätiedostossa 1 on esitetty: Kuva S8, 50 päivän viljelyn jälkeen levät ja orgaaninen aines asettuivat mikrokosmoksiin, mikä teki niistä kirkkaita kontrolliryhmässä. AZ-ryhmässä oli kuitenkin edelleen leväkukinnalle tyypillisiä piirteitä, ja se näytti vihreältä ja samealta. Tämä mielenkiintoinen ilmiö osoitti, että vaikka AZ:n pitoisuus oli alle havaitsemisrajan 15 päivän kuluttua mikrokosmoksissa (kuva 1d), suuri vaihtelu alkuvaiheessa aiheutti edelleen pysyvän vaikutuksen 50 päivään asti (lisätiedosto 1: kuva S8). AZ-jäännöksiä havaittiin laajalti vesiympäristössä, mikä osoittaa, että nämä vesistöt ovat saattaneet kerran kärsiä AZ:n lyhytaikaisesta korkeasta pitoisuudesta. Liuenneen AZ:n pitoisuus väheni nopeasti mikrokosmoksissa (kuva 1d) ja laski alle havaitsemisrajan 15 vuorokauden leväkasvatuksen jälkeen, mikä osoitti, että liuennut AZ haihtui nopeasti mikrokosmoksissa. Luonnollisissa vesijärjestelmissä AZ:n voi ottaa plankton, se voi adsorboitua orgaanisiin pintoihin ja sedimentteihin tai se voi haihtua biologisen hajoamisen ja fotolyysin kautta. Siksi AZ:n huippupitoisuuden odotetaan olevan paljon korkeampi kuin järvissä, puroissa tai pohjavedessä havaitut liuenneen AZ:n pitoisuudet, jotka vaihtelevat 0,01 ja 29,70 μg L-1 välillä, mikä viittaa siihen, että kokeissamme käytettyjen sienitautien torjunta-ainepitoisuuksien lähellä olevia pitoisuuksia voi hyvinkin esiintyä ohimenevästi, mikä aiheuttaisi pitkäaikaisia kielteisiä vaikutuksia. Esimerkiksi sienitautien torjunta-aineen Thiram® jäämiä voitiin havaita välillä 0,27-2,52 mg L-1 pintavedessä käytettyjen lohkojen ympärillä. Lisäksi erilaisia muita sienitautien torjunta-aineita, jotka voivat olla vuorovaikutuksessa AZ:n kanssa, on vesijärjestelmissä (usein adsorboituneina sedimentteihin), ja niitä voi vapautua takaisin pintaveteen sedimentin remobilisaation kautta. Tästä seuraa, että korkeat AZ-pitoisuudet ympäristössä (ainakin satunnaisesti) saattavat aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia vesieliöihin ja samalla paradoksaalisesti edistää syanobakteerien kasvua.

Sienimyrkkyjen aiheuttamaa saastumista esiintyy aina samanaikaisesti ravinteiden liikarikastumisen kanssa vesistöissä, jotka sijaitsevat lähellä maatalousalueita, joilla esiintyy usein syanobakteerikukintoja. Voimme olettaa, että rehevöitymistä ja AZ-saastetta esiintyisi samanaikaisesti rajallisella vesialueella lähellä peltoalueita sateen jälkeen, mikä aiheuttaisi dramaattisia muutoksia mikrobiyhteisön rakenteessa ja edistäisi syanobakteerikukintoja. Nämä syanobakteerit voivat siirtyä muihin vesistöihin seuraavan sateen jälkeen. Tällöin ne muuttavat saastuneiden vesien yhteisörakennetta ja edistävät läheisten vesien rehevöitymistä. Tiedetään, että mikrobien ekologisella verkostolla on oma tasapainonsa, jota rehevöityminen voi muuttaa. Tämä tutkimus osoittaa, että sienimyrkyillä voi olla tärkeä rooli HCB:n edistämisessä monimutkaisten yhteisöverkostovuorovaikutusten kautta.