Calvin-Bensonin sykli on kaikkien fotosynteettisten organismien hiilen sidonnan perusta. Kuitenkin suhteellisen vähän tiedetään siitä, missä määrin sen toiminta vaihtelee lajien välillä. Metaboliittien profilointimenetelmää käyttäen havaittiin eroja keskeisten Calvin-Bensonin syklin välituotteiden tasoissa C3- ja C4-lajien välillä. Nämä erot metaboliittivarastoissa havaittiin sekä C3-lajien välillä että C3- ja C4-kasvien välillä. Tämä työ herättää mielenkiintoisen mahdollisuuden, että Calvin-Bensonin syklin komponentteihin kohdistuvat erilaiset valintapaineet ovat johtaneet sen itsenäiseen optimointiin lajien välillä.
Melvin Calvin, Andrew Benson ja James Bassham julkaisivat vuonna 1954 ilmakehän hiilidioksidin sitomiseen käytettävän aineenvaihduntareitin, Calvin-Bensonin syklin (Bassham et al., 1954). Heidän perustavanlaatuiset löydöksensä perustuivat Chlorella-levän ruokkimiseen 14C-merkityllä CO2:lla ja aineenvaihduntatuotteiden leimautumisen jäljittämiseen ajan myötä (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). He havaitsivat, että sykli koostuu kolmesta vaiheesta: ensin entsyymi ribuloosi-1,5-bisfosfaattikarboksylaasi/oksygenaasi (Rubisco) sitoo hiilidioksidia käyttämällä akseptorina ribuloosi-1,5-bisfosfaattia (RuBP), jolloin syntyy kaksi 3-hiilistä molekyyliä, 3-fosfoglyseraattia (3-PGA). Toiseksi fotosynteesin elektroninsiirtoketjussa (fotosynteesin valoriippuvaiset reaktiot) syntyvää ATP:tä ja NADPH:ta käytetään 3-PGA:n fosforylointiin ja sen jälkeen pelkistämiseen trioosifosfaatiksi (trioosi-P). Kolmanneksi CO2-akseptori RuBP regeneroidaan useiden reaktioiden avulla (laatikko 1). Suurin osa tähän sykliin osallistuvista entsyymeistä löydettiin aiemmin tai pian sen jälkeen (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Sittemmin on yleisesti oletettu, että Calvin-Bensonin syklin toiminta on hyvin konservoitunutta eri kasvilajeissa.
Calvin-Bensonin sykli koostuu kolmesta vaiheesta: (1) hiilensidonta, (2) pelkistys ja (3) CO2-akseptorin regenerointi.
Karboksylointi tapahtuu ribuloosi-1,5-bisfosfaattikarboksylaasi/oksygenaasin (Rubisco) avulla, joka sitoo hiilidioksidia käyttämällä akseptorina ribuloosa-1,5-bisfosfaattia (RuBP) ja tuottaa näin kaksi 3-hiilistä 3-fosfoglyseraattimolekyyliä 3-PGA:ta. Fosfoglyseraattikinaasi (PGK) fosforyloi 3-PGA:n ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) pelkistää sen trioosifosfaatiksi (trioosi-P) pelkistysvaiheessa. Kierto kuluttaa 3 ATP:tä ja 2 NADPH:ta kiinteää CO2-molekyyliä kohti. Trioosi-P voidaan kuljettaa pois kloroplastista tuottamaan sakkaroosia sytosolissa. Fruktoosi-1,6-bisfosfaattialdolaasi (FBP ald) voi muuntaa trioosi-P:n fruktoosi-6-fosfaatiksi (F6P), jota käytetään tärkkelyksen tuottamiseen. Trioosi-P voidaan myös muuntaa RuBP:ksi useissa regeneraatioreaktioissa uusien CO2-molekyylien sitomiseksi.
Lyhenteet: fruktoosi-1,6-bisfosfaatti (FBP), fruktoosi-1,6-bisfosfataasi (FBPaasi), erytroosi-4-fosfaatti (E4P), sedoheptuloosa-1,7-bisfosfaatti-aldolaasi (SBP ald), sedoheptuloosa-1,7-bisfosfaatti (SBP), sedoheptuloosa-1,7-bisfosfataasi (SBPaasi), sedoheptuloosa-7-fosfaatti (S7P), transketolaasi (TK), riboosi-5-fosfaatti (R5P), ksyluloosa-5-fosfaatti (Xu5P), riboosi-5-fosfaatti-isomeraasi (RPI), ribuloosa-5-fosfaattiepideraasi (RPE), ribuloosa-5-fosfaatti (Ru5P), fosforibulokinaasi (PRK). Entsyymit, jotka katalysoivat irreversiibeleitä reaktioita, on korostettu paksulla lihavoidulla nuolella (eli Rubisco, FBPaasi, SBPaasi ja PRK).
Valta suurimmassa osassa maakasveista Calvin-Bensonin sykli sekä fotosynteesin valosta riippuvaiset reaktiot kulkevat ensisijaisesti lehtien mesofyllien solukoissa. Rubisco erottaa kuitenkin huonosti CO2:n ja O2:n toisistaan (Bowes et al., 1971), ja O2-molekyylin sitominen CO2:n sijasta johtaa fotorespiraatioon – energeettisesti kalliiseen pelastusväylään RuBP:n palauttamiseksi. Sen jälkeen, kun ilmakehän CO2-pitoisuus laski dramaattisesti 2,3 miljardia vuotta sitten (Bekker et al., 2004), kehittyi kaksi hiilen keskittymismekanismia, jotka rajoittivat fotorespiraation määrää. Nämä fotosynteesin perusprosessin muutokset, C4-fotosynteesi ja Crassulacean Acid Metabolism (CAM), syntyivät kumpikin useita kertoja (Sage et al., 2011). C4-fotosynteesiin kuuluu fotosynteesin alueellinen erottaminen siten, että sekä valosta riippuvaisten reaktioiden että Calvin-Bensonin syklin komponentit tapahtuvat mesofylli- ja nipun vaippasoluissa (laatikko 2). Huolimatta eroista hiilen sidonnan anatomisessa sijainnissa on tähän asti tiedetty vain vähän siitä, miten Calvin-Bensonin syklin toiminta voi olla erilaista C4- ja C3-kasveissa ja myös C3-kasvien välillä.
Vuonna 1966 Hal Hatch ja Roger Slack löysivät C4-fotosynteesin (Hatch ja Slack, 1966), johon liittyy hiilen tavanomaiseen C3-hiilensidontaan lisätty hiilen keskittymismekanismi. He osoittivat 14C-merkinnän avulla, että sokeriruo’on lehdissä hiilidioksidi sidottiin ensin 4-hiilihapoksi eikä 3-fosfoglyseraatiksi (3-PGA) kuten C3-kasveissa. C4-kasvit käyttävät fosfoenolipyruviittikarboksylaasia (PEPC) ensimmäisenä hiiltä sitovana entsyyminä mesofyllisoluissa. Mesofyllisoluissa tuotettu nelihiilihappo (malaatti tai aspartaatti C4-fotosynteesin tyypistä riippuen) kulkeutuu sitten nipun vaippasoluihin, joissa se dekarboksyloituu ja CO2 vapautuu. Tämän hiilikonsentraatiomekanismin ansiosta Rubisco voi toimia lähes yksinomaan karboksylaasina Calvin-Bensonin syklin aikana nipun vaipan soluissa. Olemassa olevien metabolisten entsyymien uudelleenkonfiguroinnin lisäksi C4-reitti edellyttää lehtien erikoistunutta anatomiaa (Kranzin anatomia), johon kuuluu suonten välyksen ja nipun tuppisolujen koon kasvattaminen. Perinteisesti on tunnistettu kolme erilaista C4-fotosynteesityyppiä, jotka on nimetty sen ensisijaisen entsyymin mukaan, joka vastaa dekarboksylaatioreaktiosta nipun vaippasoluissa: NAD-ME, NADP-ME tai PEPCK-tyyppi. Lyhenteet: hiilihappoanhydraasi (CA), oksaloasetaatti (OA), NADP-riippuvainen malaattidehydrogenaasi (NADP-MDH), malaatti (M), NADP-riippuvainen omenahappoentsyymi (NADP-ME), pyruvaatti (Pyr), pyruvaatti-, ortofosfaattidikinaasi (PPDK), fosfoenolipyruvaatti (PEP).
Calvin-Bensonin syklin aineenvaihduntatuotteiden vaihtelu lajien välillä
Calvin-Bensonin sykli on epäilemättä yksi maapallon kriittisimmistä biokemiallisista reiteistä, sillä se on kasvien hiilen assimilaatioreitti – fotosynteesin sydän. Mutta toimivatko kaikki kasvilajit tätä reittiä samalla tavalla? Arrivault et al. (2019) profiloivat Calvin-Bensonin syklin aineenvaihduntatuotteiden runsauden viidestä C3-kasvista (mukaan lukien Arabidopsis ja useat tärkeät viljelykasvit, kuten riisi, vehnä ja maniokki) ja neljästä C4-kasvista (mukaan lukien maissi). Kokonaismetaboliitit uutettiin kypsistä lehdistä ja mitattiin käyttämällä käänteisfaasinestekromatografiaa yhdistettynä tandem-massaspektrometriaan (LC-MS/MS). Luotettavaa kvantifiointia varten näytteisiin lisättiin isotooppimerkittyjä sisäisiä metaboliittistandardeja; 3-PGA kvantifioitiin entsymaattisesti. Eri kasvilajien metaboliittiprofiileja verrattiin pääkomponenttianalyysin avulla.
Silmiinpistävää oli, että Arrivault ym. (2019) havaitsivat huomattavia eroja Calvin-Benson-syklin välituotteiden metaboliittiprofiileissa tutkimiensa viiden C3-lajin välillä. Eniten vaihtelevia välituotteita olivat 3-PGA:n, trioosi-P:n, ribuloosi-5-fosfaatin (Ru5P) ja ksyluloosi-5-fosfaatin (Xu5P) absoluuttiset määrät. RuBP:n suhteelliset tasot verrattuna RuBP:n regeneraatioon osallistuvien välituotteiden tasoihin vaihtelivat lajien välillä. Lisäksi kirjoittajat osoittivat vaihtelua metaboliittiparien, kuten fruktoosi-1,6-bisfosfaatin (FBP) ja fruktoosi-6-fosfaatin (F6P), jotka liittyvät toisiinsa FBPaasin irreversiibelillä reaktiolla, sekä metaboliittiparin sedoheptuloosi-1,7-bisfosfaatti (SBP) ja sedoheptuloosa-7-fosfaatti (S7P) suhteellisissa pitoisuuksissa, jotka SBPaasi muuntaa irreversiibelisti. Useimmissa tapauksissa viisi C3-lajia erottuivat selvästi toisistaan pääkomponenttianalyysissä. Se, missä määrin ne erottuivat toisistaan, riippui siitä, normalisoitiinko tiedot tuorepainoon, klorofyllipitoisuuteen vai proteiinipitoisuuteen. Näiden välituotteiden vaihtelu viiden C3-lajin sisällä viittaa eroihin siinä, miten kasvit käyttävät samaa hiilensidontapolkua. Tällä tiedolla on seurauksia strategioille, joilla pyritään parantamaan fotosynteesiä. Esimerkiksi SBPaasi voi rajoittaa fotosynteesin nopeutta (Zhu et al., 2007) ja yliekspressio voi lisätä fotosynteesin tehokkuutta (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Näin ollen yksittäisen Calvin-Bensonin syklin entsyymin aktiivisuuden muuttaminen voi vaikuttaa fotosynteesin nopeuteen ja sen jälkeen biomassaan ja satoon. Tämän lähestymistavan tehokkuuden tiedetään kuitenkin vaihtelevan lajeittain. Arrivault et al. (2019) raportoima SBP- ja S7P-metaboliittien tasojen ennakkovaihtelu C3-lajien välillä on siksi tärkeää, ja se voi antaa tietoa fotosynteesin vaihtelevasta vasteesta SBPaasin määrien kasvattamiselle.
Koska C4-kasvien hiilensidontamekanismi rajoittaa fotorespiraatiota, ei ehkä ollut niinkään yllättävää, että fotorespiraation ensimmäinen tuote, 2-fosfoglykolaatti (2-phosphoglycolate (2-PG), oli C4- lajeissa harvinaisempi kuin C3- lajeissa. Lisäksi C4-kasveilla oli vähemmän RuBP:tä kuin C3-kasveilla, mikä on johdonmukaista niiden pienemmän Rubisco-investoinnin kanssa. Kuitenkin, vaikka 2-PG- ja RuBP-tasot jätettiin pois aineistosta, C3- ja C4-metaboliittien tasot erottuivat lähes aina toisistaan pääkomponenttianalyysissä. Nämä erot olivat johdonmukaisia riippumatta siitä, normalisoitiinko tiedot tuorepainoon, klorofyllipitoisuuteen vai proteiinipitoisuuteen, joten muutokset viittaavat siihen, että aineenvaihduntatuotteiden tuottamisesta vastaavat entsyymit suorittavat katalyysiä eri nopeuksilla eri lajeissa. Kirjoittajat käyttävät näitä eroja kuvaamaan termiä ”Calvin-Bensonin syklin toimintatapa”, jonka mukaan sykli toimii eri tavoin eri lajeissa, vaikka siihen osallistuvat samat entsyymit, mikä johtaa havaittuihin muutoksiin välituotteiden suhteellisissa määrissä. He ehdottavatkin, että C3- ja C4-kasvien väliset erot Calvin-Bensonin syklin toiminnassa ovat laajempia kuin pelkkä alueellinen siirtyminen nipun vaippasoluihin jälkimmäisissä kasveissa, ja että niihin liittyy sopeutuminen syklin toimintatapaan.
Tulevaisuuden näkymät
Toteamus siitä, että Calvin-Bensonin syklin toimintatapa voi vaihdella, on mielenkiintoinen, varsinkin kun otetaan huomioon, että reitin rakenne (siihen osallistuvien entsyymien ja niiden reaktiojärjestyksen suhteen syklin sisällä) on hyvin säilynyt. Miljoonien vuosien aikana, jotka ovat kuluneet syklin ensimmäisestä esiintymisestä, ilmakehän O2:n ja CO2:n suhde on kuitenkin muuttunut dramaattisesti. Näiden muutosten uskotaan vaikuttaneen siihen, että jotkin kasvilajit ovat kehittäneet hiilensidontamekanismeja. Kirjoittajat ehdottavat nyt, että alhaiset CO2-pitoisuudet yhdessä erityisten ympäristöolosuhteiden kanssa ovat saattaneet johtaa erilaisten Calvin-Bensonin syklin toimintatapojen kehittymiseen. Näin ollen havaitut vaihtelut metaboliaprofiileissa saattavat heijastaa erilaisia valintapaineita, jotka vaikuttavat siihen, miten Calvin-Bensonin sykliä säädellään eri kasvilinjoissa. Lähestymistapaa, jota kirjoittajat käyttivät Calvin-Bensonin syklin välituotteiden analysoinnissa, voitaisiin nyt soveltaa useampiin lajeihin, ja tämä olisi erityisen mielenkiintoista, jos ne kattaisivat laajemman valikoiman kasviperheitä erilaisissa ympäristöissä. Tämä voisi paljastaa, seuraako vaihtelu tiukasti fylogeneettisiä taksoneita vai erityisiä ympäristöjä, joihin kasvit ovat sopeutuneet.
Myös Arrivault et al. analysoimat C4-kasvit harjoittavat kaikki NADP-ME-tyyppistä C4-fotosynteesiä. Siten lupaava jatkotutkimuslinja olisi tutkia, havaitaanko kaikissa kolmessa C4-metabolian tyypissä samanlaisia muutoksia Calvin-Bensonin syklin välituotteissa vai ovatko ne NADP-ME-tyypille ominaisia.
Tämä työ on erinomainen lähtökohta sen selvittämiseksi, miten näitä eri Calvin-Bensonin syklin moodeja hallitaan molekyylitasolla. Vaikka metaboliittiprofiilien profilointi mahdollistaa puolueettoman lähestymistavan arvioida välituotteiden tasojen vaihtelua eri lajien välillä, näiden erojen taustalla olevat syyt ovat vielä selvittämättä. Lajien välinen vaihtelu voi johtua eroista geeniekspressiossa ja siitä johtuvassa proteiinien aktiivisuudessa, kinetiikkaan vaikuttavasta aminohapposekvenssin vaihtelusta tai entsyymien translaation jälkeisestä säätelystä. Huomionarvoista on, että lähes kaikki Calvin-Bensonin syklin entsyymit ovat ainakin jonkinlaisen redox-säätelyn alaisia, useimmiten tioredoksiini (TRX)/ferredoksiini (Fd) -järjestelmän kautta (Buchanan ja Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Näiden transkriptio-, proteiinirunsaus- ja entsyymiaktiivisuustietojen integrointi metaboliatasoihin voi paljastaa vaihtelun molekyylisen perustan. Lisäksi havaitut vaihtelut metaboliittivarastoissa voivat liittyä myös tiettyjen välituotteiden, erityisesti Calvin-Bensonin syklistä poistuvien välituotteiden, vaatimuksiin. Esimerkiksi syklin läpi kulkevaan virtaukseen voivat vaikuttaa poistumisreitit, jotka mahdollistavat tärkkelyksen synteesin (F6P:n kautta), sakkaroosin ja isoprenoidien synteesin (trioosi-P:n kautta), aminohappojen synteesin shikimaattireitin kautta (E4P:n kautta) sekä tiamiinin ja nukleotidien synteesin (R5P:n kautta) (Raines, 2011) (Raines, 2011).”
Arrivault ym. raportoivat tutkimuksessaan (2019) mielenkiintoisesta variaatiosta, joka liittyy siihen, kuinka eri kasvilajeissa Calvin-Benson-kierron komponentit toimivat. Tämä katalysoi varmasti lisätutkimuksia siitä, miten kasvit ovat sopeuttaneet tämän perustavanlaatuisen ja ikivanhan hiilen sidontapolun erilaisiin ympäristöihin.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
3.,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
.
.
.
,
.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
.
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
,
, et al.
.
.
,
.
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
. doi: .
,
,
.
.
.
,
–
.
.