May 12, 2018
Yksi yleinen kysymys, jonka tutkijat aina kysyvät saadessaan signaalin vasta-ainepohjaisesta määrityksestä, on: ”
Vasta-aineen spesifisyys on aina tutkijoiden huolenaihe. Vaikka spesifisyystesteissä on käytetty useita validointimenetelmiä, tietoja tulkitaan usein liikaa. Eri ryhmien tutkimustiedot ovat osoittaneet, että jotkut markkinoilla yleisesti käytetyt monoklonaaliset vasta-aineet eivät itse asiassa ole monospesifisiä. Ne voivat ristireagoida muiden proteiinien kanssa.Ja ristireaktiivisuus voi johtaa tutkijoita harhaan väärillä positiivisilla tuloksilla ja mahdollisesti aiheuttaa odottamattomia sivuvaikutuksia ja vääriä diagnostisia raportteja lääkäreille.
Mitkä ovat siis kontrollit, joita meidän pitäisi käyttää vasta-aineiden spesifisyyden validoinnissa?
Positiivisina kontrolleina vasta-aineen validoinnissa voidaan käyttää solulinjoja ja kudoksia, jotka ilmentävät kohdeproteiineja suurina määrinä.Kyseessä voi olla sisäsyntyinen proteiini tai cDNA- eli cDNA- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna- eli dna-biologisen geeniperimäisen proteiinin tuottama, ekspressoida. Positiivinen kontrolli ei kuitenkaan pysty vahvistamaan vasta-aineen spesifisyyttä. Voit nähdä oikean kokoisen kaistan tai positiivisen värjäytymisen oikeassa subcellulaarisessa paikassa, mutta ne kaikki voivat olla vääriä positiivisia signaaleja, jotka johtuvat vasta-aineen ristireaktiivisuudesta. Tavallisesti vasta-aineen validoinnissa tarvitaan siis negatiivinen kontrolli epäspesifisen sitoutumisen arvioimiseksi.
Knockout-validointi on toistaiseksi paras negatiivinen kontrolli vasta-aineen spesifisyyden arvioimiseksi. Knockout-validoinnissa vasta-ainetta testataan knockout-solulinjalla, joka ei ilmentä kohdeproteiinia. Vuodesta 2017 alkaen OriGene on liittoutunut CRISPR-innovaattorin EdiGenen kanssa tuottaakseen kaksois-knockout-soluja korkean läpimenon menetelmällä. Toisin kuin Horizonin knockout-solulinja, OriGenen knockout-solulinjat ovat peräisin yleisesti käytetyistä solulinjoista, kuten HEK293T:stä tai HeLa:sta, mikä tekee tuotteesta merkityksellisemmän tutkijoille.Tässä kaksinkertaisessa knockout-solulinjassa vasta-ainekohdetta ei esiinny, koska proteiinia koodaava geeni on eliminoitu tai ”knocked out”. Knockout-soluista ja vanhemmista soluista (villityyppi) saadut näytteet testataan rinnakkain samaa vasta-ainetta vastaan, ja jos vasta-aine on todella spesifinen, sen pitäisi havaita spesifinen signaali vain villityypin solussa mutta ei knockout-solulinjassa. Olemme validoineet yli 100 monoklonaalista vasta-ainetta (KO-validoidut vasta-aineet) näiden knockout-solujen lyseaattien avulla. Knockout-validoinnin uskotaan tarjoavan todellisen negatiivisen kontrollin vasta-aineen spesifisyyden testaamiseen.
Mutta riittääkö knockout-validointi vasta-aineen monospesifisyyden vahvistamiseen? Suhtaudun tähän johtopäätökseen varovaisesti. Ensinnäkin knockout-solujen off target -vaikutuksia ei ole tässä vaiheessa tutkittu hyvin. Niinpä knockout-solu voi poistaa kiinnostavan proteiinin ilmentymisen lisäksi myös toisen proteiinin ilmentymisen tai vähentää sen ilmentymistä, joka voi olla vasta-aineen kanssa ristireagoiva proteiini. Negatiivinen signaali ei siis aina tarkoita, että vasta-aine ei reagoi muiden proteiinien kuin kiinnostavan proteiinin kanssa. Toiseksi testaaminen knockout-soluilla/-kudoksella on mahdollista vain ei-välttämättömien proteiinien osalta. Välttämättömien proteiinien osalta knockout on mahdotonta. Näitä proteiineja varten tarvitaan siis jokin muu tapa testata vasta-aineen spesifisyys.
OriGene kehitti muutama vuosi sitten proteiiniryhmämenetelmän vasta-aineen spesifisyyden testaamiseen. Maailman suurimman yliekspressiolysaattikokoelman avulla olemme valmistaneet ainutlaatuisen proteiinipiirin, joka sisältää >10k yliekspressoitua ihmisen proteiinia kahtena kappaleena yhdellä nitroselluloosalla päällystetyllä lasilevyllä. Tätä proteiinimikrosirutekniikkaa on käytetty monien OriGeneUltraMAB™-monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyden validointiin. Lisäämällä proteiinien lukumäärää mikrosirulla, vasta-aineen ristireaktiivisuutta voidaan tutkia tarkemmin koko ihmisen proteasomin alueella.
Yhteenvetona voidaan todeta, että vasta-aineiden spesifisyyden testaaminen on melko monimutkaista. Se on validoitava useiden välineiden ja suuntien avulla.Kun teknologia kehittyy edelleen, meillä on enemmän arvokkaita resursseja ja standardoituja menettelyjä vasta-aineiden validointia varten.Tutkijat eivät enää joudu saman kysymyksen eteen, kun he saavat positiivisia signaaleja vasta-ainepohjaisista määrityksistään.