Bioaktiivisuuden testaaminen – Anti-streptokokkiaktiivisuus
Kolmea erilaista vihreää teetä ja niiden uutteita ja hiukkasia, jotka on saatu 5000 rpm, 10000 rpm ja 20000 rpm kierrosluvuilla, tutkittiin niiden antibakteeristen ominaisuuksien varalta hammaslääketieteellisen patogeenin S.mutansin suhteen. Vihreän teen uutteen pitoisuuden optimoimiseksi jatkokokeita varten testattiin kuutta eri pitoisuutta (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL ja 500 μL) GT-0:sta (ilman hiukkasen poistoa) ja 5K-S:stä GT 1:stä, GT 2:sta ja GT 3:sta S. mutansia vastaan. Kuvassa 2 esitetään tämän tutkimuksen tulokset. Kuten kuvasta 2(a) havaitaan, spektrofotometrinen menetelmä osoitti, että GT-0:n ja 5K-S:n osalta kaikkien kolmen vihreän teen osalta antistreptokokkiaktiivisuus kasvoi pitoisuuden kasvaessa. Havaittiin, että 300 μl:n pitoisuudet osoittivat optimaalista antimikrobista aktiivisuutta, ja siksi niitä pidettiin optimoituna pitoisuutena kaikissa muissa tämän tutkimuksen kokeissa. Tästä lähtien kaikki kokeet suoritettiin käyttäen 300 μl:n pitoisuuksia vihreän teen muuttujia. Kuvassa 2 b) esitetään tulokset, jotka saatiin antimikrobisen vaikutuksen arvioinnissa käyttäen elinkykyisten kokonaislukumäärän menetelmää. Levyjen laskentatulokset korreloivat spektrofotometriin perustuvissa sameusmittauksissa havaittujen tulosten kanssa. Toinen mielenkiintoinen havainto, joka havaittiin näistä tuloksista, on se, että mikrobilääkeaktiivisuus parani marginaalisesti, kun hiukkasia poistettiin 5000 rpm:n kierrosluvulla (5K-S) verrattuna GT-0:aan. Verrattuna GT 1-0:aan GT 1-5K-S osoitti lisääntynyttä antibakteerista aktiivisuutta, samoin kuin GT 2 ja GT 3. Lisäksi GT 3:lla havaittiin olevan korkein antibakteerinen aktiivisuus ja GT 1:llä vähiten antibakteerista aktiivisuutta.
Testimuuttujien pitoisuusvaikutuksen optimointi mikrobilääkkeiden antimikrobiseen aktiivisuuteen a) spektrofotometrisen optisen tiheyden määritysmenetelmän ja b) elinkykyisten organismien lukumäärän menetelmällä.
Koska hiukkasten poistaminen vihreästä teestä osoitti muutoksia vihreän teen uutteen bioaktiivisuudessa, ehdotettiin yksityiskohtaista tutkimusta tämän vaikutuksen tutkimiseksi. Suoritettiin järjestelmällinen kolmivaiheinen sentrifugointiprosessi 5000 rpm, 10 000 rpm ja 20 000 rpm, jonka tarkoituksena oli erottaa suurimmat, pienemmät ja vielä pienemmät hiukkaset uutteesta. Suurista hiukkasista (5K-S), pienistä hiukkasista (10K-S) ja hienoista hiukkasista (20K-S) eroon päässeestä uutteesta sekä hiukkasista (5K-P, 10K-P ja 20K-P) tutkittiin niiden vuorovaikutusta S. mutansin kanssa ja niiden yksilöllisiä antibakteerisia vaikutuksia. Kuvassa 3 esitetään tämän tutkimuksen tulokset. Kuten kuvasta 3 (a-1, a-2) havaitaan, sekä sameuteen perustuva menetelmä että lautaslaskentamenetelmä vahvistivat, että GT 1:n osalta 5K-P:n poistaminen johti uutteen (5K-S) antibakteerisen aktiivisuuden lisääntymiseen (marginaalinen lisääntyminen) verrattuna GT 1-0:aan. 10K-P:n poistaminen ei lisännyt aktiivisuutta entisestään, ja 10K-S:n todettiin yleensä olevan samanlainen kuin 5K-S:n aktiivisuus. Kuitenkin 20K-P:n poistaminen johti 20K-S:n antimikrobisen aktiivisuuden selvään vähenemiseen. Tämä havainto oli ilmeinen GT 2:n (kuva 3(b-1,b-2)) ja GT 3:n (kuva 3(c-1,c-2)) tapauksessa. Vaikka suuntaus vaihteli eriasteisesti GT 1:stä GT 2:een ja GT 3:een, se, että suurten vihreän teen hiukkasten poistaminen uutteesta lisäsi marginaalisesti vihreän teen uutteen antibakteerista ominaisuutta ja että pienempien vihreän teen hiukkasfraktioiden poistaminen uutteesta johti vihreän teen antibakteerisen aktiivisuuden selvään vähenemiseen, on edelleen kiistaton.
Kuvio, jossa verrataan eri testikomponenttien (a) GT 1:n, (b) GT 2:n ja (c) GT 3:n antibakteerisia aktiivisuuksia (a,b,c -1) spektrofotometriamenetelmällä ja (a,b,c -2) Kokonaisviabiliteettilukumäärän laskemisella.
On kuitenkin tärkeää korostaa tässä yhteydessä, että kumpikaan 5K-P-, 10K-P- tai 20K-P-hiukkasista ei osoittanut parempaa itsenäistä antibakteerista aktiivisuutta kuin uutteet. 5K-P-partikkelit osoittivat nolla antibakteerista aktiivisuutta, 10K-P osoitti vähäistä antibakteerista aktiivisuutta, kun taas 20K-P:t osoittivat jonkin verran aktiivisuutta kahden muun vastineen keskellä.
Hammasbakteerien reaaliaikainen testaaminen
Voidaksemme arvioida tätä vihreän teen uutteiden bioaktiivisuuden vaihtelua vihreän teen partikkeleista eroon päässeiden vihreän teen partikkeleiden bioaktiivisuuden vaihtelua reaaliaikaisissa systeemeissä, uutteet asetettiin vastakkain hammasbakteerien biofilmin reaaliaikaisiin näytteisiin, jotka saatiin viideltä eri vapaaehtoiselta ihmiseltä. Testattiin GT 0, 5K-S ja 20K-S GT 1, GT 2 ja GT 3. Kuvassa 4 esitetään elinkelpoisten bakteerien kokonaismäärät lautaslaskentamenetelmän jälkeen, mikä osoittaa, mitkä bakteerit selvisivät vihreän teen vuorovaikutuksesta. Oli mielenkiintoista havaita, että näytteen monimutkaisuudesta huolimatta verrattuna GT 0:aan 5K-S osoitti lisääntynyttä antibakteerista aktiivisuutta, kun taas 20K-S osoitti vähentynyttä antibakteerista aktiivisuutta suhteessa kaikkiin kolmeen vihreään teehen.
Tulokset, jotka osoittavat onnistuneen hammaslääketieteellisen antibakteerisen vaikutuksen, joka osoitettiin viideltä vapaaehtoiselta ihmiseltä saaduista todellisista näytteistä.
Solujen fluoresenssikuvaus akridiinioranssia käyttäen, auttaa elävien/kuolleiden solujen visualisoinnissa ja erottelussa hoidon jälkeen. Kuvasimme hampaiden biofilminäytteet viideltä vapaaehtoiselta ennen ja jälkeen vuorovaikutuksen GT 0:n, 5K-S:n ja 20K-S:n sekä kontrollin kanssa. Kuvassa 5 esitetään fluoresenssitulokset, jotka osoittavat vihreän teen muuttujien vaikutuksen vapaaehtoiseen 1 (A), vapaaehtoiseen 2 (B), vapaaehtoiseen 3 (C), vapaaehtoiseen 4 (D) ja vapaaehtoiseen 5 (E). Kuten kuvasta 5(a) havaitaan, A:n, B:n, C:n, D:n ja E:n kontrollikuvissa näkyy pääasiassa oranssia fluoresenssia, joka osoittaa aktiivisesti metaboloituvien elävien hammasbakteerien läsnäoloa. Kuten kuvasta havaitaan, hampaista irronneet biofilmit säilyttivät biofilmi-identiteettinsä ja näyttäytyivät mikrobimatoina kontrollien tapauksessa. GT 0 -käsittely johti vihreän teen odotettuun tappavaan vaikutukseen (kuva 5(b)) kaikkien vapaaehtoisten kohdalla. Vihreästi fluoresoivat alueet (kuolleet solut) olivat vallitsevia, ja niiden välissä oli oranssin fluoresenssin alueita. Paneelissa (c) esitetään tulokset GT 3:n 5K-S supernatantista, jossa suurimmat vihreän teen partikkelit poistettiin uutteesta. Kuten fluoresenssimikroskooppisista kuvista havaitaan, oranssia fluoresenssia ei havaittu lainkaan ja täydellinen vihreä fluoresenssi osoitti hammasbakteerien/biokalvon täydellistä tuhoutumista. Oli myös mielenkiintoista havaita, että kaikissa testinäytteissä (A(c), B(c), C(c), D(c) ja E(c)) ei havaittu enää biofilmilaikkuja tai -mattoja, vaan biofilmimatot olivat hajonneet, ja kaikissa näytteissä (A(c), B(c), C(c), D(c) ja E(c)) oli nähtävissä vain hajanaisia solurykelmiä. Lopuksi kuvassa 5(d) esitetään 20K-S-vuorovaikutustulokset, ja vihreän teen uutteen tappava vaikutus on selvästi vähentynyt merkittävästi. Oranssina fluoresoivien elävien bakteerisolujen esiintyminen osoittaa, että uutteen antimikrobinen aktiivisuus vähenee vihreän teen nanokomponenttien poistamisen yhteydessä. Vaikka vihreänä fluoresoivia kuolleita soluja havaitaan myös, elävien ja kuolleiden solujen suhde näyttää muuttuneen. Nämä tulokset vahvistivat spektrofotometrisen menetelmän ja lautaslaskentamenetelmän avulla raportoidun suuntauksen eri testattavien vihreän teen komponenttien antimikrobisesta aktiivisuudesta.
Epifluoresenssimikroskooppikuva, joka kuvaa suun biofilmin elävä/kuollut-luonnetta (A) Vapaaehtoisesta 1 (B) Vapaaehtoisesta 2 (C) Vapaaehtoisesta 3 (D) Vapaaehtoisesta 4 seuraavissa tilanteissa: (a) Kontrolli (ei GT-ainesosaa), (b) GT 0 (c) 5K-S (d) 20K-S, joka kuuluu GT 3:een.
FE-SEM-havainto kontrollin ja 5K-S:n vuorovaikutuksessa olleista hammasbakteereista on esitetty kuvassa 6 (a-c). Kuten kuvasta havaitaan, kontrollissa (kuva 6 (a)) on hyvin kehittynyt biofilmi (vapaaehtoinen 4), kun taas GT 0 (kuva 6 (b)) GT 3:n ja 5K-S:n (kuva 6 (c)) vuorovaikutus johti solujen ja biofilmin vaurioitumiseen, kuten solujätteet osoittavat. CLSM:llä otetut kuvat (d) osoittavat, että GT 3 (5K-S) tappoi valtaosan kaikkien viiden vapaaehtoisen hammasbakteereista. GT 3-GT 0 ja 5K-S osoittautuivat lupaavimmiksi kaikkien vapaaehtoisten hammasbakteereja vastaan.
FE-SEM-kuvat hammasnäytteestä V4:ltä (a) kontrolli (käsittelemätön) (b,c) GT 3:lla käsiteltyjä näytteitä, joissa näkyvät laajamittaiset vauriot vihreän teen kanssa inkuboinnin jälkeen. (d) esittää solujen CLSM-kuvat, joissa fluoresoivat solut edustavat kuolleita soluja viidellä eri vapaaehtoisella GT 3 20K-P:llä tehdyn käsittelyn jälkeen.
Urteen ja partikkelien karakterisointi
Vihreän teen komponenttien antibakteeriseen aktiivisuuteen perustuvien bioaktiivisuustestien tulosten osoittaessa, että vihreän teen partikkelien läsnäolo ja puuttuminen muuttavat itse asiassa uutteen aktiivisuutta, on tarpeen karakterisoida yksityiskohtaisesti kolmen vihreän teen uutteet GT 0, 5K-S, 10K-S ja 20K-S ja sen jälkeen partikkelit 5K-P, 10K-P ja 20K-P.
Biokemiallinen karakterisointi
Antibakteerinen aktiivisuus määräytyy yleensä uutteen kokonaisfenolien, flavanoidien ja antioksidanttikyvyn mukaan. Kaikkia näitä parametreja tutkittiin ja verrattiin tässä tutkimuksessa käytettyjen uutteiden ja hiukkasten kesken. Kuvassa 7(a) esitetään GT 1:stä saadut tulokset, ja flavanoidien osalta, kuten kaaviosta havaitaan, flavanoidipitoisuudessa ei havaittu suurta eroa GT 0-, 5K-S-, 10K-S- ja 20K-S-uutteiden välillä, ja GT 0:lla näyttäisi olevan marginaalinen lisäys muihin uutteisiin verrattuna. Vihreän teen hiukkasten osalta 5K-P:n flavanoidipitoisuus oli kuitenkin korkein, ja 10K-P:n ja 20K-P:n flavanoidipitoisuudet olivat samankaltaisia kuin uutteissa. GT 2:n (kuva 7 b) ja GT 3:n (kuva 7 c) flavanoidipitoisuudet olivat erilaiset, 5K-S- ja 10K-S-uutteissa oli korkeimmat flavanoidipitoisuudet verrattuna GT 0:aan. 5K-P- ja 10K-P-hiukkasissa flavanoidipitoisuudet olivat hyvin alhaiset. Poikkeuksena oli, että 20K-S-uutteissa oli vähemmän flavanoideja muihin uutteisiin verrattuna ja 20K-P-hiukkasissa oli enemmän flavanoideja muihin hiukkasiin verrattuna.
Komponenttien a) GT 1, b) GT 2 ja c) GT 3 biokemiallisten aktiivisuuksien vertailu niiden antioksidanttisen aktiivisuuden (DPPH:n avulla), flavonoidipitoisuuden (AlCl3-menetelmällä) ja kokonaisfenolipitoisuuksien (foliinien kokonaispitoisuus) (DPPH:n avulla) perusteella.
Kokonaisfenolien osalta GT 1:ssä korkein arvo oli GT 0:lla, kun taas muilla oli pienemmät arvot. GT 2:ssa ja GT 3:ssa havaittiin kuitenkin jälleen samanlainen suuntaus fenolipitoisuudessa, jossa kaikkien uutteiden fenolipitoisuudet olivat lähes samanlaiset. Mutta 5K-P:n ja 10K-P:n fenolipitoisuudet olivat pienimmät verrattuna 20K-P:hen.
Antioksidanttisen aktiivisuuden osalta GT 1:n uutteet (GT 0, 5K-S, 10K-S ja 20K-S) osoittivat erittäin korkeaa antioksidanttista aktiivisuutta, kun taas 5K-P:n ja 10K-P:n antioksidanttinen aktiivisuus oli kuusi kertaa pienempi. Tässä yhteydessä on kuitenkin mainittava, että 20K-P:n antioksidanttinen aktiivisuus oli huomattavasti suurempi kuin 5K-P:n ja 10K-P:n. GT 2:ssa ja GT 3:ssa tämä suuntaus oli selvempi, ja 5K-S:n ja 10K-S:n antioksidanttinen aktiivisuus oli korkeampi kuin GT 0:ssa. 20K-S:n antioksidanttinen aktiivisuus kuitenkin väheni selvästi, kun taas GT 2:n ja GT 3:n 20K-P:n aktiivisuus lisääntyi vastaavasti. On huomattava, että tutkituista kolmesta vihreästä teestä GT 3:ssa todettiin korkeammat arvot näille bioaktiivisille yhdisteille, ja sen jälkeen seurasi tiiviisti GT 2, ja viimeisenä huomattavasti perässä jäi GT 1. Tämän jälkeen GT 1:n aktiivisuus väheni selvästi. Tämä suuntaus korreloi vahvasti vihreiden teiden antimikrobisen bioaktiivisuuden kanssa, joka oli järjestyksessä GT 3 > GT 2 > > GT1.
FE-SEM-analyysi
5K-P-, 10K-P- ja 20K-P-hiukkaset kuvattiin FE-SEM-menetelmällä, jotta saatiin selville niiden morfologiset yksityiskohdat ja koko. Kuvassa 8 esitetään GT 1:stä (A), GT 2:sta (B) ja GT 3:sta (C) peräisin olevien hiukkasten 5K-P (a), 10K-P (b) ja 20K-P (c) morfologiat. Useimmissa tapauksissa havaittiin epäsäännöllinen morfologia, jossa ei ollut selvää muotoa. Kuten kuvasta 8 havaitaan, GT 1:n ja GT 2:n 5K-P:n hiukkasten havaittiin olevan makrokokoisia, ja nämä hiukkaset näkyivät näkyvästi kupissamme vihreää teetä. Taulukossa 1 esitetään niiden koot, GT 2:n (B) 5K-P-hiukkaset olivat suurimmat (50-80 μm), ja GT 1:n (B(a)) hiukkaset olivat kooltaan 15-25 μm. GT 3 5K-P -hiukkaset olivat suhteellisen pienempiä, 6-30 μm (kuva 8 (C(a)). Kuten mikrokuvista havaittiin, hiukkaset eivät olleet kiinteän kokoisia, mikä on odotettavissa tällaisilta karkeilta, standardoimattomilta kaupallisilta näytteiltä. 10K-P:n hiukkaset olivat mikrokokoluokassa 4-10 μm GT 1:n tapauksessa (A(b)), GT 2:n tapauksessa 2-10 μm (kuva 8B(b)) ja GT 3:n tapauksessa 0,5-3 μm (C(b)). 20K-P:n hiukkaset olivat pienempiä mikro- tai nanokokoisia, GT 1:n hiukkaset olivat 0,5-6 μm:n alueella (A(c)), GT 2:n hiukkaset (B(c)) olivat 200-540 nm:n kokoisia ja GT 3:n (C(c)) hiukkaset olivat pienimmän kokoluokan hiukkasia, jotka olivat kokoluokassa 50 nm-300 nm. Kuten nämä tulokset osoittavat, 20K-P:n hiukkaset, joilla oli tehostettuja bioaktiivisia komponentteja ja jotka osoittivat antioksidanttista ja antibakteerista ominaisuutta, havaittiin esiintyvän lähes nanokokoluokassa.
FE-SEM-mikroskooppikuvat (a) 5K-P:stä, (b) 10K-P:stä ja (c) 20K-P:stä GT:stä 1 (A), GT:stä 2 (B) ja GT:stä 3 (C), joissa näkyvät uuttuneiden partikkeleiden morfologiatiedot ja koko. Sisäkuvissa on optiset mikrokuvat vastaavista hiukkasista.
UV-Vis-spektrofotometria
Kuvassa 9 on esitetty EGCG-pitoisuuksien osalta karakterisoitujen uutteiden ja hiukkasten UV-Vis-spektri. Atomssa & Gotlap 201539 on raportoitu katekiiniperheen absorbanssi: EGCG:n absorbanssi on 248-361 nm:n alueella vedessä ja λmax 273,6 nm:ssä; ECG 246- 363 nm λmax 276,8 nm:ssä; EGC:n spektrialue vedessä on 254-378 nm ja λmax 269,6 nm:ssä ja EC:n spektrialue on 252-328 nm ja λmax 278,4 nm:ssä. Kuten kuvassa 9(a) GT-1 havaitaan, EGCG:n absorptiopiikki näkyy ainoastaan 273 nm:ssä. EGCG-piikin osalta ei havaittu eroa uutteissa (GT 0, 5K-S, 10K-S ja 20K-S). Vihreän teen hiukkasten osalta havaittiin kuitenkin, että 20K-P:n hiukkasissa EGCG:n intensiteetti kasvoi merkittävästi verrattuna 5K-P:hen ja 10K-P:hen. Oli mielenkiintoista havaita, että 20K-P:ssä oli lähes 50 % uutteiden sisältämästä EGCG:stä.
UV- Näkyvyysspektrit eri vihreän teen komponenteista, joita käytettiin testimuuttujina tässä tutkimuksessa.
GT 2:n tapauksessa havaittiin, että uutteissa esiintyi muita katekiiniperheeseen kuuluvia piikkejä 248-363 nm:n alueella, kuten havaittiin tämän alueen eri piikkipiikeistä kuvassa 9(b). Hiukkasten poistaminen uutteesta johti piikkien siirtymiseen. Erityisesti uutteissa oli selviä siirtymiä. Hiukkasten 5K-P ja 10K-P osalta havaittiin kuitenkin, että niissä näkyi ainoastaan EGCG-piikkejä ja alhaisella intensiteetillä. Tässä yhteydessä korostetaan 20K-P-hiukkasia, joissa katechiinipiikit olivat lähes yhtä voimakkaita kuin uutteissa. Havaittiin, että toisin kuin 5K-P:ssä ja 10K-P:ssä, 20K-P:ssä ei näkynyt ainoastaan EGCG-piikkejä, vaan myös muita katekiiniperheen piikkejä, jotka olivat melko samanlaisia kuin uutteissa.
GT 3 (Kuva 9(c)), uutteista saatiin erilaisia piikkejä, myös katekiinipiikkejä. GT 1:een ja GT 2:een verrattuna 5K-P- ja 10K-P-hiukkasissa oli kuitenkin itse EGCG-piikkejä, joiden intensiteetti oli korkea. Suuntaus, jonka mukaan 5K-P:ssä ja 10K-P:ssä oli vain EGCG-piikki, jatkui myös GT 3:ssa. 5K-P:n EGCG-pitoisuus oli korkeampi kuin GT-1- ja GT 2-pitoisilla hiukkasilla, mutta verrattuna GT 3:n 10K-P:hen se oli paljon alhaisempi. GT 3:n 10K-P:n EGCG-pitoisuudet olivat samankaltaisia kuin uutteissa. Tässä tapauksessa 20K-P:ssä havaittiin korkeimmat katekiinipiikit, jotka ylittivät myös uutteet. Piikkien siirtymät olivat samankaltaisia kuin vesiuutossa ja liuotinuutossa havaitut 20K-P:n ja uutteiden välillä. Oli mielenkiintoista huomata, että 20K-P:n piikit olivat kapeampia ja voimakkaampia. 20K-P:ssä havaittiin poikkeuksellisen korkea piikki 269 nm:ssä, joka vastasi EGC:tä. Yleinen havainto siitä, että 20K-P:t sisälsivät huomattavan suuria määriä katekiineja GT-1:ssä, GT 2:ssa ja GT 3:ssa, vahvistettiin näillä tutkimuksilla.
FT-IR
Ft-IR-spektri, joka saatiin GT 3:n hiukkasista 5K-P:stä, 10K-P:stä ja 20K-P:stä, jotka osoittivat maksimaalista antibakteerista aktiivisuutta ja yksilöllisiä ominaisuuksia, on esitelty kuvassa 10(a). Spektri vastaa EGCG:n ominaiskaistaa. Ponnuraj et al, 201540 raportoivat EGCG:n sormenjäljen olevan 3357,46 cm-1 aromaattiseen renkaaseen kiinnittyneelle O-H-ryhmälle, 1691,27 cm-1 ja 1616,06 cm-1 vahvasti C = O-ryhmälle, joka yhdistää trihydroksibentsoaattiryhmän ja kromaaniryhmän, 1447,31 cm-1 kromaanirenkaassa olevalle C-H-ryhmälle, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 O-C = O-ryhmälle, 1148,40 cm-1 O-H-ryhmälle, 1041,37 cm-1 C-O-C-ryhmälle, joka yhdistää kromaanirenkaan ja trihydroksibentsoaattirenkaan, ja 825,38 cm-1 C-H-ryhmälle aromaattisessa renkaassa. Oli mielenkiintoista ja tukevaa havaita, että sentrifugoinnin kasvaessa havaittiin selkeä kuvio, joka vastaa pienenevää hiukkaskokoa. 5K-P:ssä EGCG:n kaistat olivat intensiteetiltään alhaisimmat, minkä jälkeen 10K-P:ssä ja 20K-P:ssä esiintyi voimakkaita kaistoja. Tämä korreloi myös UV-tutkimuksissa havaittujen tulosten kanssa.
FT-IR-tulokset 5K-P:stä, 10K-P:stä ja 20K-P:stä eristetyistä 5K-P-, 10K-P- ja 20K-P-hiukkasista, jotka on eristetty a) GT:stä 3; b) GT:stä 1 peräisin olevista 5K-P:stä ja 20K-P:stä ja c) GT:stä 1, 2 ja 3 eristetyistä nanohiukkasista.
Kuvassa 10 b) esitetään GT 1:n 5K-P:stä ja 20K-P:stä saadut FT-IR-spektrit, GT 1:n tapauksessa EGCG-kaistoissa ei ollut suurta eroa näiden kahden hiukkasen välillä. Nämä tulokset vastaavat myös UV-spektrofotometrisissä tutkimuksissa havaittuja tuloksia. Kuvassa 10(c) esitetään GT 1:n, GT 2:n ja GT 3:n 20K-P:n vertailuspektrit. EGCG:n lisääntyneiden kaistojen gradienttikuvio järjestyksessä GT 1 < GT 2 < GT 3 on ilmeinen.