Activité bactéricide des extraits de thé vert : l’importance des nanoparticules contenant de la catéchine

Tests de bioactivité- Activité antistreptococcique

Les trois différents thés verts et leurs extraits et particules obtenus à 5000 rpm et 10000 rpm et 20000 rpm ont été étudiés pour leurs propriétés antibactériennes contre l’agent pathogène dentaire, S.mutans. Afin d’optimiser la concentration de l’extrait de thé vert pour des expériences ultérieures, six concentrations différentes (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL et 500 μL) de GT-0 (sans enlever la particule) et de 5K-S de GT 1, GT 2 et GT 3 ont été testées contre S. mutans. La figure 2 présente les résultats de cette étude. Comme observé sur la figure 2(a), la méthode spectrophotométrique a révélé que dans le cas de GT-0 et 5K-S par rapport aux trois thés verts, l’activité anti-streptococcique augmente avec la concentration. Les concentrations de 300 μL ont été observées pour montrer une activité antimicrobienne optimale et donc distinguées comme la concentration optimisée pour toutes les autres expériences de cette étude. Ainsi, à partir de maintenant, toutes les expériences ont été réalisées en utilisant des concentrations de 300 μL des variables du thé vert. La figure 2(b) montre les résultats obtenus par l’évaluation antimicrobienne en utilisant la méthode de comptage total des viables. Les résultats de la numération sur plaque sont en corrélation avec ceux observés dans le cas des mesures de turbidité basées sur le spectrophotomètre. Une autre observation intéressante tirée de ces résultats est l’amélioration marginale de l’activité antimicrobienne observée lors de l’élimination des particules à 5000 rpm (5K-S) par rapport à GT-0. Par rapport à GT 1-0, GT 1-5K-S a montré une activité antibactérienne accrue, de même que GT 2 et GT 3. En outre, on a observé que le GT 3 présentait l’activité antibactérienne la plus élevée et le GT 1 la plus faible.

Puisque l’élimination des particules du thé vert a montré des changements dans la bioactivité de l’extrait de thé vert, il a été proposé de faire une enquête détaillée sur l’étude de cet effet. Un processus de centrifugation systématique en trois étapes, à 5000 rpm, 10 000 rpm et 20 000 rpm, destiné à séparer les particules les plus grosses, les plus petites et les encore plus petites de l’extrait a été réalisé. L’extrait débarrassé des grandes particules (5K-S), des petites particules (10K-S) et des fines particules (20K-S) et les particules (5K-P, 10K-P et 20K-P) ont été étudiés pour leur interaction avec S. mutans et leurs activités antibactériennes individuelles. La figure 3 présente les résultats de cette étude. Comme observé dans la figure 3 (a-1, a-2), la méthode basée sur la turbidité et la méthode de comptage des plaques ont confirmé que, en ce qui concerne le GT 1, l’élimination des 5K-P a entraîné une amélioration (amélioration marginale) de l’activité antibactérienne de l’extrait (5K-S) par rapport au GT 1-0. L’élimination du 10K-P n’a pas entraîné d’amélioration supplémentaire et l’activité du 10K-S s’est avérée similaire à celle du 5K-S. Cependant, l’élimination des 20K-P a entraîné une perte distincte de l’activité antimicrobienne de la 20K-S. Cette observation est évidente dans le cas de la GT 1-0. Cette observation a été observée comme étant évidente dans le cas du GT 2 (Fig. 3(b-1,b-2)) et du GT 3 (Fig. 3(c-1,c-2)). Bien que la tendance ait eu des degrés de variation variables de GT 1 à GT 2 à GT 3, mais le fait que l’élimination des grandes particules de thé vert de l’extrait a marginalement augmenté la propriété antibactérienne de l’extrait de thé vert et que l’éradication des fractions de particules de thé vert plus petites de l’extrait a conduit à une nette diminution de l’activité antibactérienne du thé vert reste incontestable.

Cependant, il est important de souligner ici que ni les particules 5K-P, 10K-P ou 20K-P n’ont montré une activité antibactérienne autonome accrue supérieure à celle des extraits. Les particules 5K-P ont montré une activité antibactérienne nulle, 10K-P a montré une étendue limitée de l’activité antibactérienne, tandis que les 20K-P ont montré une certaine activité parmi les deux autres homologues.

Test en temps réel de la bactérie dentaire

Afin d’évaluer cette variation dans la bioactivité des extraits de thé vert débarrassés des particules de thé vert dans les systèmes en temps réel, les extraits ont été mis contre des échantillons réels de biofilm dentaire de cinq volontaires humains différents. Les GT 0, 5K-S et 20K-S de GT 1, GT 2 et GT 3 ont été testés. La figure 4 donne le nombre total de bactéries viables selon la méthode de comptage sur plaque, indiquant les bactéries qui ont survécu à l’interaction avec le thé vert. Il était intéressant d’observer que malgré la complexité de l’échantillon, par rapport au GT 0, 5K-S a montré une activité antibactérienne accrue, tandis que 20K-S a montré une activité antibactérienne réduite par rapport aux trois thés verts.

Imagerie par fluorescence des cellules en utilisant l’acridine orange, aide à la visualisation et à la différenciation entre les cellules vivantes/mortes après le traitement. Nous avons imagé les échantillons de biofilm dentaire des cinq volontaires avant et après l’interaction avec GT 0, 5K-S et 20K-S et le contrôle. La figure 5 montre les résultats de fluorescence montrant l’effet des variables du thé vert sur le volontaire 1 (A), le volontaire 2 (B), le volontaire 3 (C), le volontaire 4 (D) et le volontaire 5 (E). Comme observé sur la Fig 5(a), les images de contrôle en A, B, C, D et E montrent une fluorescence orange prédominante indiquant la présence de bactéries dentaires vivantes en métabolisation active. Comme on peut le voir sur l’image, le biofilm délogé des dents a conservé son identité de biofilm et apparaît comme un tapis microbien dans le cas du témoin. Le traitement GT 0 a eu l’effet de destruction attendu du thé vert (Fig. 5(b)) chez tous les volontaires. Les zones de fluorescence verte (cellules mortes) ont prédominé, avec des zones de fluorescence orange coexistantes. Le panneau (c) représente les résultats du surnageant 5K-S du GT 3, où les plus grandes particules de thé vert ont été retirées de l’extrait. Comme observé sur les images de microscopie à fluorescence, il n’y avait aucune fluorescence orange observée et une fluorescence verte complète indiquant l’annihilation totale des bactéries/biofilms dentaires. Il est également intéressant d’observer que l’on n’observe plus de plaques ou de tapis de biofilm, les tapis de biofilm ont été désintégrés et tout ce que l’on voit, ce sont des amas de cellules éparses dans tous les échantillons testés (A(c), B(c), C(c), D(c) et E(c). Enfin, la Fig. 5(d) donne les résultats de l’interaction 20K-S, une baisse significative de l’effet de destruction de l’extrait de thé vert est évidente. L’apparition de cellules bactériennes vivantes à fluorescence orange indique une diminution de l’activité antimicrobienne de l’extrait lors de l’élimination des composants nanométriques du thé vert. Bien que des cellules mortes fluorescentes vertes soient également observées, le rapport entre les cellules vivantes et mortes semble altéré. Ces résultats ont confirmé la tendance rapportée via la méthode spectrophotométrique et la méthode de comptage sur plaque de l’activité antimicrobienne des différents composants du thé vert testés.

L’observation par FE-SEM de la bactérie dentaire témoin et de la bactérie 5K-S en interaction est donnée dans la figure 6 (a-c). Comme observé sur la figure, le contrôle (Fig. 6(a)) montre un biofilm bien développé (Volontaire 4), tandis que l’interaction GT 0 (Fig. 6(b)) de GT 3 et 5K-S (Fig. 6(c)) a entraîné la détérioration des cellules et du biofilm, comme l’indiquent les débris cellulaires. Les images capturées à l’aide du CLSM (d) montrent qu’une grande majorité des bactéries dentaires des cinq volontaires ont été tuées par le GT 3 (5K-S). Les GT 3-GT 0 et 5K-S se sont avérés les plus prometteurs contre les bactéries dentaires de tous les volontaires.

Caractérisation de l’extrait et des particules

Avec les résultats des tests de bioactivité basés sur l’activité antibactérienne des composants du thé vert montrant que la présence et l’absence des particules de thé vert modifient effectivement l’activité de l’extrait, il est nécessaire que les extraits GT 0, 5K-S, 10K-S et 20K-S puis les particules 5K-P, 10K-P et 20K-P des trois thés verts soient caractérisés de manière élaborée.

Caractérisation biochimique

L’activité antibactérienne est généralement régie par les phénols totaux, les flavanoïdes et la capacité antioxydante d’un extrait. Tous ces paramètres ont été étudiés et comparés entre les extraits et les particules utilisés dans cette étude. La figure 7(a) montre les résultats obtenus dans le cas de GT 1, dans le cas des flavanoïdes, comme on peut le voir sur le graphique, il n’y a pas beaucoup de différence dans la teneur en flavanoïdes entre les extraits GT 0, 5K-S, 10K-S et 20K-S, GT 0 semble montrer une augmentation marginale par rapport au reste. Cependant, dans le cas des particules de thé vert, 5K-P a enregistré la teneur en flavanoïdes la plus élevée, suivie de 10K-P et 20K-P dans des gammes de flavanoïdes similaires à celles trouvées dans les extraits. Dans le cas de GT 2 Fig. 7(b) et GT 3 Fig. 7(c) la teneur en flavanoïdes était différente, les extraits 5K-S et 10K-S ont montré les teneurs en flavanoïdes les plus élevées par rapport à GT 0. Les particules 5K-P et 10K-P ont montré des teneurs en flavanoïdes très faibles. Les exceptions sont que les extraits 20K-S ont montré moins de flavanoïdes par rapport aux autres extraits et les particules 20K-P ont montré plus de flavanoïdes par rapport aux autres particules.

En ce qui concerne les phénols totaux, dans le GT 1, le plus élevé a été trouvé dans le GT 0, tandis que le reste a montré des valeurs inférieures. Cependant, dans le cas de GT 2 et GT 3, il a été de nouveau observé qu’une tendance similaire a été observée dans le cas du contenu phénolique, où tous les extraits ont montré des contenus phénoliques presque similaires. Mais le 5K-P et le 10K-P ont montré les contenus phénoliques les moins élevés par rapport au 20K-P.

En termes d’activité antioxydante, les extraits du GT 1 (GT 0, 5K-S, 10K-S et 20K-S) ont montré une activité antioxydante très élevée, tandis que le 5K-P et le 10K-P ont montré une activité antioxydante six fois plus faible. Cependant, il faut mentionner ici que les 20K-P ont montré une activité antioxydante significativement plus élevée par rapport aux 5K-P et 10K-P. Dans les GT 2 et GT 3, cette tendance était plus prononcée, les 5K-S et 10K-S présentant une activité antioxydante plus élevée que le GT 0. Mais une nette diminution de l’activité antioxydante a été observée dans le cas du 20K-S avec une augmentation correspondante de l’activité dans les 20K-P des GT 2 et GT 3. Il convient de noter que parmi les trois thés verts étudiés, le GT 3 a enregistré des valeurs plus élevées de ces composés bioactifs, suivi de près par le GT 2 et, enfin, le GT 1, nettement à la traîne. Cette tendance est fortement corrélée avec la bioactivité antimicrobienne des thés verts qui était dans l’ordre de GT 3 > GT 2 > GT1.

Analyse FE-SEM

Les particules 5K-P, 10K-P et 20K-P ont été imagées en utilisant FE-SEM pour leurs détails morphologiques et leurs tailles. La figure 8 donne les morphologies 5K-P (a), 10K-P (b) et 20K-P (c) des particules de GT 1 (A), GT 2(B) et GT 3 (C). Des morphologies irrégulières, sans forme distincte, ont été observées dans la plupart des cas. Comme on peut le voir sur la figure 8, les particules 5K-P des GT 1 et GT 2 ont été observées comme étant de taille macro, ce sont celles que nous voyons visiblement dans notre tasse de thé vert. Le tableau 1 affiche leurs tailles, les particules 5K-P de GT 2 (B) étaient les plus grandes (50-80 μm), suivies de celles de GT 1(B(a)) dont la taille était comprise entre 15 et 25 μm. Les particules GT 3 5K-P étaient relativement plus petites, dans la plage de 6-30 μm (figure 8(C(a))). Comme observé dans les micrographies, les particules n’étaient pas de tailles fixes, ce qui est attendu de tels échantillons commerciaux bruts non normalisés. Les particules 10K-P étaient dans les gammes de taille micro de 4-10 μm dans le cas de GT 1 (A(b)), GT 2 était de 2-10 μm (Fig. 8B(b)) et GT 3 dans la gamme de taille de 0,5-3 μm (C(b)). Les particules 20K-P étaient plus petites, de micro à nanométriques, avec des particules GT 1 dans le régime de 0,5-6 μm (A(c)), les particules GT 2 (B(c)) étaient de 200 nm à 540 nm et les particules GT 3 (C(c)) étaient les moins dimensionnées existant dans le régime de taille de 50 nm-300 nm. Ainsi, comme le montrent ces résultats, on a observé que les particules 20K-P qui possédaient des composants bioactifs améliorés et montraient une propriété antioxydante et antibactérienne existaient dans le régime proche du nanomètre.

Spectrophotométrie UV-Vis

La figure 9 donne le spectre UV-Vis des extraits et des particules caractérisés pour leur teneur en EGCG. Atomssa & Gotlap 201539 ont rapporté l’absorbance pour la famille des catéchines : L’EGCG présente une absorbance dans la gamme de 248-361 nm dans l’eau avec un λmax à 273,6 nm ; ECG 246- 363 nm λmax à 276,8 nm ; la gamme spectrale de l’EGC dans l’eau est de 254-378 nm et λmax à 269,6 nm et celle de EC est de 252-328 nm avec λmax à 278,4 nm. Comme observé dans la Fig. 9(a) GT-1, nous ne voyons que le pic d’absorption de l’EGCG à 273 nm. En termes de pic d’EGCG, aucune différence n’a été observée entre les extraits (GT 0, 5K-S, 10K-S et 20K-S). Cependant, dans le cas des particules de thé vert, on a observé que les particules 20K-P ont montré une augmentation significative de l’intensité de l’EGCG par rapport aux particules 5K-P et 10K-P. Il était intéressant d’observer que les 20K-P détenaient près de 50% de l’EGCG contenu dans les extraits.

Dans le cas du GT 2, il a été observé que les extraits présentaient la présence d’autres pics de la famille des catéchines dans la plage de 248-363 nm, comme le montrent les différents pics dans cette plage sur la figure 9(b). L’élimination des particules de l’extrait a entraîné des décalages des pics. Les extraits en particulier ont montré des décalages distincts. Cependant, dans le cas des particules 5K-P et 10K-P, on a observé qu’elles présentaient uniquement des pics d’EGCG et à faible intensité. L’accent est mis ici sur les particules 20K-P qui ont montré des pics de catéchine d’intensité presque similaire à ceux des extraits. On a observé que, contrairement aux 5K-P et 10K-P, les 20K-P ne présentaient pas seulement des pics d’EGCG mais aussi les autres pics de la famille des catéchines, assez semblables aux extraits.

GT 3 (Fig. 9(c)), les extraits ont donné divers pics, y compris les pics de catéchines. Cependant, comparé à GT 1 et GT 2, les particules 5K-P et 10K-P ont elles-mêmes montré des pics d’EGCG de haute intensité. La tendance selon laquelle les particules 5K-P et 10K-P ne présentaient que des pics d’EGCG s’est maintenue dans le GT 3 également. Les 5K-P présentaient un pic d’EGCG plus élevé que leurs homologues des GT-1 et GT 2, mais il était beaucoup plus faible que celui des 10K-P du GT 3. Les 10K-P du GT 3 présentaient des teneurs en EGCG similaires à celles des extraits. Dans ce cas, les 20K-P ont enregistré les pics de catéchine les plus élevés, dépassant également les extraits. Des déplacements de pics ont été observés, similaires à ceux rapportés dans l’extraction à l’eau et l’extraction au solvant dans le cas des 20K-P par rapport aux extraits. Il est intéressant de noter que les pics du 20K-P sont plus étroits et de haute intensité. Un pic exceptionnellement élevé à 269 nm correspondant à l’EGC a été observé dans les 20K-P. L’observation générale selon laquelle les 20K-P contenaient des quantités significativement élevées de catéchines dans les GT-1, GT 2 et GT 3 a été confirmée par ces études.

FT-IR

Le spectre FT-IR obtenu à partir des particules 5K-P, 10K-P et 20K-P du GT 3 qui ont montré l’activité antibactérienne maximale et des propriétés uniques est présenté dans la figure 10(a). Les spectres correspondent à la bande caractéristique de l’EGCG. Ponnuraj et al, 201540 rapportent les empreintes de l’EGCG à 3357,46 cm-1 pour le groupe O-H attaché au cycle aromatique, 1691,27 cm-1 et 1616,06 cm-1 forts pour le groupe C = O qui relie le groupe trihydroxybenzoate et le groupe chromane, 1447,31 cm-1 pour le groupe C-H présent dans le cycle chromane, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 pour le groupe O-C = O, 1148,40 cm-1 pour le groupe O-H, 1041,37 cm-1 pour le groupe C-O-C qui relie le cycle chromane et le cycle trihydroxybenzoate et 825,38 cm-1 pour le groupe C-H dans le cycle aromatique. Il était intéressant et encourageant d’observer qu’un schéma distinct était observé en fonction de l’augmentation de la centrifugation qui correspond à la diminution de la taille des particules. À 5K-P, les bandes d’EGCG étaient les plus faibles en intensité, suivies par 10K-P et 20K-P qui présentaient des bandes de haute intensité. Ceci est en corrélation avec les résultats observés dans les études UV également.

La figure 10(b) affiche les spectres FT-IR obtenus à partir de GT 1 5K-P et 20K-P, Dans le cas de GT 1, il n’y avait pas beaucoup de différence dans les bandes d’EGCG entre les deux particules. Ces résultats correspondent également à ceux observés dans le cas des études spectrophotométriques UV. La figure 10(c) donne les spectres comparatifs des 20K-P de GT 1, GT 2 et GT 3. Le modèle de gradient d’augmentation des bandes d’EGCG dans l’ordre de GT 1 < GT 2 < GT 3 est évident.