La famille des médiateurs de transport de cations métalliques divalents à domaine de paire de cystathionine-β-synthase (CBS) (CNNMs) est composée de quatre protéines membranaires intégrales associées au transport de Mg2+. Structurellement, les CNNMs contiennent de grandes régions cytosoliques composées d’une paire CBS et d’un domaine CNBH (cyclic nucleotide-binding homology). La façon dont ces domaines régulent l’activité de transport du Mg2+ est inconnue. Ici, nous avons déterminé les structures cristallines des fragments cytosoliques dans deux conformations : Mg2+-ATP-analogue lié et sans ligand. Les structures révèlent des conformations ouvertes et fermées avec des contacts fonctionnellement importants non observés dans les structures des domaines individuels. Nous avons également identifié une deuxième région de liaison au Mg2+ dans le domaine de la paire CBS et une interface de dimérisation différente pour le domaine CNBH. Des expériences d’ultracentrifugation analytique et de calorimétrie par titrage isotherme ont révélé une corrélation étroite entre la liaison Mg2+-ATP et la dimérisation de la protéine. Les mutations qui bloquent l’une ou l’autre de ces fonctions empêchent l’activité cellulaire d’efflux de Mg2+. Les résultats suggèrent que l’efflux de Mg2+ est régulé par des changements conformationnels associés à la liaison de Mg2+-ATP aux domaines de la paire CBS de CNNM.