Canaux ioniques et transporteurs de chlorure : des curiosités de la nature et source de maladies humaines aux cibles médicamenteuses

Cela satisfait pratiquement tous les cas de figure, de la salle de classe au laboratoire de recherche, jusqu’à ce que l’on considère les canaux chlorures. Nous savons qu’ils existent, qu’ils sont importants et qu’ils pourraient constituer de bonnes cibles médicamenteuses dans plusieurs domaines de la maladie, mais jusqu’à récemment, ils sont restés quelque peu stigmatisés et démodés dans le monde de la thérapeutique. Le manque de ligands sélectifs n’a pas aidé du tout. La seule exception à cette règle est le récepteur GABA-A qui est couplé à un canal chlorure intrinsèque qui s’ouvre lors de la liaison du neurotransmetteur inhibiteur GABA. Les benzodiazépines potentialisent ce récepteur depuis que le Valium est devenu disponible dans les années 1960, ce qui leur confère des effets sédatifs et anticonvulsifs. Ceci introduit un concept important : il existe plusieurs familles de gènes et différents types de protéines qui peuvent être décrits comme étant des canaux chlorures.

Ceci contraste avec ce que nous comprenons des canaux ioniques sélectifs des cations où il y a peu de flexibilité dans la structure de la protéine qui peut former un pore sélectif pour le potassium, le sodium ou le calcium ; la diversité de ces canaux ioniques est apportée par les variations des domaines protéiques distincts du pore qui influencent le comportement d’ouverture-fermeture. Pour être juste, il ne semble pas y avoir beaucoup de raisons physiologiques pour lesquelles un canal anionique devrait présenter une sélectivité pour le chlorure, car il y a peu de rôle physiologique dans le transport membranaire d’autres halogénures ou petits anions ; tout canal anionique sera par défaut un canal de chlorure d’un point de vue physiologique. D’autre part, les courants membranaires de potassium, de sodium et de calcium jouent chacun des rôles fondamentaux différents et la perméabilité membranaire sélective à ces cations est cruciale pour la fonction cellulaire et même la vie elle-même.

Les récepteurs GABA-A sont des membres des familles de canaux ioniques ligandés pentamériques à boucle cys, qui comprennent plusieurs types de canaux excitateurs et inhibiteurs commandés par des neurotransmetteurs. La protéine CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) est un canal chlorure régulé par les nucléotides. Elle fait partie de la famille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette) et est la seule qui ne semble pas transporter de substrat à travers une membrane, mais qui fonctionne plutôt comme un canal de chlorure. La famille CLC des canaux chlorure dépendants du voltage provient d’une autre famille de gènes distincte et possède une structure générale unique parmi les protéines membranaires. Cette famille de protéines a apporté de nombreuses surprises au cours des 30 dernières années et les membres de cette famille seront présentés ici et aussi comment ils pourraient être considérés comme des cibles médicamenteuses.

D’autres développements passionnants du domaine des canaux de chlorure ont émergé suite à l’identification moléculaire des protéines sous-jacentes aux canaux de chlorure activés par le calcium (ClCa). Sur le plan fonctionnel, nous connaissons leurs rôles physiologiques depuis un certain temps, mais l’identification moléculaire récente des protéines des canaux a permis le développement d’outils moléculaires et pharmacologiques pour sonder et modifier leur activité. Cette revue se concentre sur le potentiel pharmacologique du ciblage des canaux ClCa et des protéines CLC ; leur fonction et leur localisation subcellulaire sont résumées dans la figure 1.

Une introduction aux protéines CLC

Les neuf membres de cette famille de protéines sont CLC-1 à 7, CLC-KA et KB. Le membre fondateur, CLC-1, est le canal chlorure voltage-dépendant du muscle squelettique et sera discuté ci-dessous. De nombreuses études fonctionnelles ont été menées sur un homologue portant le titre honorifique de CLC-0, isolé de l’organe électrique de l’Electroplax, qui permet à la raie d’étourdir ses victimes aquatiques. La reconstitution de CLC-0 dans des bicouches lipidiques et l’enregistrement électrophysiologique des courants circulant dans des canaux ioniques uniques ont révélé une propriété intrigante. Habituellement, lorsqu’on enregistre un courant à partir d’une petite parcelle de membrane contenant un seul canal ionique, on observe des fluctuations entre deux amplitudes de courant : l’une représentant le canal fermé et l’autre représentant le courant circulant dans le canal ouvert. Ces fluctuations reflètent les transitions entre les états cinétiques ouvert et fermé. Avec CLC-0, cependant, il était évident que la protéine unique du canal ionique était constituée de deux pores équivalents qui pouvaient s’ouvrir indépendamment1. Ce canal a donc été décrit comme étant à double barillet (figure 2). Il n’a donc pas été très surprenant que les structures cristallines d’homologues provenant de bactéries entériques révèlent que le complexe protéique était un dimère, chaque sous-unité possédant une voie conductrice d’ions2 (figure 2).

La deuxième surprise est apparue lorsque des expériences fonctionnelles détaillées ont été menées sur CLC-ec1 de E. coli. Plutôt que de fonctionner comme un canal de chlorure, comme son parent disparu depuis longtemps dans le muscle squelettique des vertébrés, CLC-ec1 est un transporteur d’échange 2Cl-/H+, ou antiporteur, avec une stœchiométrie d’échange stricte de 2:13. Cette protéine est importante pour la survie des bactéries entériques à faible pH4 et est susceptible d’exploiter un gradient de chlorure pour maintenir le pH cellulaire à un niveau tolérable. Les CLC procaryotes pourraient donc être des cibles pour des inhibiteurs destinés à traiter les infections pathogènes à E. coli ou Salmonella4. La découverte du comportement d’échange d’ions a naturellement stimulé d’autres efforts pour déterminer si cet échange chlorure contre proton existait dans les CLC des mammifères, en partant du principe que l’échange Cl-/H+ pourrait être la véritable fonction des CLC archétypaux et que ceux identifiés comme des canaux de chlorure pourraient n’être que des exceptions à la règle. Cela semble être le cas, car il existe des preuves solides que les CLC-3 à CLC-7 fonctionnent comme des transporteurs d’échange 2Cl-/H+, résidant principalement dans les organelles intracellulaires, tandis que les CLC-1, CLC-2, KA et KB sont de véritables canaux ioniques conducteurs de chlorure de la membrane plasmique5-9. Étant donné que la propriété archétypale des CLC est le transport par échange, se retrouvant dans toutes les formes de vie cellulaire, cette dernière sous-classe de protéines, les canaux chlorures bona fide, peut donc être considérée comme des transporteurs de chlorures « cassés », qui ont perdu le couplage du transport de chlorures au mouvement d’un second ion substrat.

CLC-1

Ce fondateur de la famille CLC est le canal chlorure voltage-dépendant du muscle squelettique et sert à réguler le potentiel membranaire et à repolariser la membrane après des potentiels d’action pour détendre le muscle. Dans la plupart des tissus, on s’attendrait à ce que les canaux potassiques jouent ce rôle, ce qu’ils font dans les muscles cardiaques et lisses, et qu’ils régulent l’excitabilité de la membrane dans d’autres types de cellules. Le système tubulaire transverse est une extension de la membrane plasmique (sarcolemme) et pénètre dans le tissu contractile. Il est essentiel à la propagation rapide de l’activité électrique dans tout le muscle et orchestre une contraction rapide et contrôlée. L’efflux de potassium des cellules musculaires vers l’espace confiné du tubule t augmenterait la concentration extracellulaire de potassium et effondrerait ce gradient ionique, ce qui entraînerait une dépolarisation prolongée de la membrane. Les canaux chlorure jouant le rôle repolarisant prédominant, ce phénomène est évité. Les mutations de perte de fonction dans CLC-1 entraînent une myotonie chez l’homme, la chèvre et la souris (pour une revue récente, voir10) et se caractérisent par une relaxation musculaire altérée, cohérente avec la perte d’un courant membranaire repolarisant.

Avec une expression confinée au muscle squelettique, CLC-1 pourrait être une cible attrayante pour les médicaments qui contrôlent la contraction musculaire en augmentant ou en diminuant la fonction de CLC-1 et ainsi réduire ou augmenter l’excitabilité musculaire, respectivement. Les composés qui augmentent la fonction de CLC-1 pourraient être en mesure de traiter la myotonie, en particulier dans les cas où ils pourraient compenser la perte partielle de l’activité du canal chlorure. L’inhibition de CLC-1 pourrait réduire le seuil de contraction musculaire et pourrait être utile en cas de faiblesse musculaire ou de maladies dégénératives telles que la dystrophie musculaire.

CLC-2

Le canal chlorure à redressement vers l’intérieur, CLC-2, a une distribution tissulaire assez étendue. On le trouve dans les neurones centraux où il régule l’activité neuronale11-13. Dans les astrocytes, son ciblage subcellulaire aux jonctions cellulaires est régulé par une interaction avec GlialCAM (MLC1), dont les mutations perturbent ce ciblage et provoquent une leucoencéphalopathie mégalencéphalique14. Des intérêts thérapeutiques récents impliquent l’expression de CLC-2 dans la muqueuse intestinale et les bronchioles pulmonaires où il joue un rôle dans les sécrétions intestinales et pulmonaires, respectivement. On a proposé que la lubiprostone, un médicament utilisé en clinique pour soulager la constipation, exerce son effet en activant CLC-2, mais cet effet est controversé. Alors que ce composé active les canaux CLC-2 dans certaines études, dans d’autres il régule le trafic CLC-2 et augmente la fonction CFTR via l’activation des récepteurs des prostaglandines15,16. Cependant, il reste suffisamment de preuves que l’augmentation de la fonction des CLC-2 dans les voies aériennes pourrait fournir une voie alternative pour le chlorure dans la mucoviscidose17.

CLC-KA/KB

Ces canaux chlorure sont notamment exprimés dans les épithéliums rénaux et contribuent à la perméabilité des membranes cellulaires au flux passif de chlorure. Ils ont un rôle clé dans le membre ascendant et les tubules distaux du néphron, en fournissant une voie basolatérale pour la réabsorption du chlorure, après son transport depuis l’urine primaire via la membrane apicale. Le gène CLCKB, qui code pour CLC-KB, est l’un des cinq gènes à l’origine du syndrome de Bartter. Les mutations de perte de fonction dans le gène CLC-KB entraînent un défaut de réabsorption du chlorure et conduisent ainsi à un trouble de l’élimination du sel, qui est associé à une polyurie. L’une des principales caractéristiques des personnes affectées par les mutations du gène CLC-KB (type III de Bartter) est l’hypotension artérielle. Une forme plus grave de la maladie est causée par des mutations du gène BSND (type IV de Bartter), qui code pour la Barttine, une protéine accessoire importante pour le trafic de la CLC-KA et de la KB vers la membrane plasmique18. Cette forme de la maladie comprend également la surdité sensorielle, que l’on pense être provoquée par la perte du trafic de la CLC-KA et de la KB vers les membranes épithéliales de l’oreille interne. On peut supposer que la perte de l’activité de CLC-KA ou de KB, mais pas des deux, peut être tolérée par le système auditif. Ceci suggère que les inhibiteurs sélectifs de la CLC-KA ou de la CLC-KB, ou l’inhibition partielle des deux, pourraient agir comme un nouveau diurétique de l’anse avec le potentiel d’abaisser la pression artérielle et avec peu d’effets secondaires. Cela a conduit à l’étude de leur pharmacologie et à la mise au point de nouveaux dérivés inhibiteurs à faible affinité micromolaire19, qui ont eu des effets diurétiques lorsqu’ils ont été administrés à des rats20. D’autre part, les médicaments qui activent les canaux CLC-KB peuvent améliorer l’activité résiduelle des canaux défectueux chez les patients atteints du type III de Bartter.

CLC-7

Dans la sous-classe des transporteurs d’échange 2Cl-/H+, CLC-7 est une cible prometteuse pour l’action des médicaments et son inhibition pourrait être bénéfique dans l’ostéoporose. Une fois de plus, cette indication trouve son origine dans les observations de la maladie humaine causée par des mutations de perte de fonction dans le CLC-7, qui provoquent l’ostéropétrose21. Dans cette maladie, le remodelage osseux par les ostéoclastes est déficient, ce qui serait dû à un défaut de sécrétion d’acides et d’enzymes. Il en résulte un os dense qui, s’il est reproduit par un inhibiteur de CLC-7, pourrait réduire la dissolution de l’os et donc renforcer le squelette des patients atteints d’ostéoporose22,23. Dans des études de preuve de concept, l’inhibition pharmacologique de l’acidification24 ou la perturbation de la fonction de CLC-7 par des anticorps25 ont réduit la résorption osseuse. Cependant, l’inhibition de la CLC-7 n’est peut-être pas sans complications, car des études sur l’homme et la souris suggèrent que l’absence de fonction de la CLC-7 peut également être associée à des troubles de stockage et de dégénérescence neuronale en raison d’une fonction lysosomale réduite26.

Mutations humaines à perte de fonction – leçons de CFTR

Il vaut la peine de faire une brève pause à ce stade pour considérer que certaines des indications thérapeutiques pour les nouveaux médicaments ciblant la CLC visent à traiter des troubles distincts et à l’opposé de ceux qui sont causés par une fonction défectueuse de la CLC. En plus de celles décrites ci-dessus, la maladie de Dent I est une maladie rénale liée au chromosome X qui est causée par la perte de la fonction de la CLC-5 (voir27 pour une revue récente). Toutes ces maladies sont des troubles héréditaires rares et un défaut majeur de la protéine implique soit une activité réduite de la protéine, soit son trafic vers la membrane cible. En fait, de nombreuses mutations individuelles provoquent la rétention du RE et un manque de maturation de la protéine. Un parallèle pourrait être établi avec la mucoviscidose, la plupart des personnes atteintes possédant la mutation ΔF508 à rétention du RE. Les approches récentes et stratifiées du traitement de la mucoviscidose sont le résultat d’une double attaque visant à corriger le repliement des protéines mutantes (correcteurs de la mucoviscidose) et/ou à augmenter l’activité des canaux chlorure CFTR de la membrane plasmique (potentialisateurs de la mucoviscidose). Des succès émergent avec la classe des potentiateurs28, qui sont efficaces chez les patients présentant des mutations qui réduisent l’activité du CFTR sans perte de la biosynthèse ou du trafic des protéines (par exemple G551D), mais l’efficacité des correcteurs de repliement (qui sont nécessaires dans la majorité des cas) reste à établir29. Bien que les maladies associées à la perte de la fonction CLC soient toutes des troubles génétiques rares, nous pourrons peut-être un jour traiter les personnes atteintes de myotonie, du syndrome de Bartter, de la maladie de Dent et de l’ostéopétrose, ainsi que de la mucoviscidose, avec des médicaments qui corrigent la cause réelle de leur trouble.

Canaux de chlorure activés par le calcium

Enfin, on mentionnera les canaux de chlorure activés par le calcium (ClCa), qui ont des rôles physiologiques clairement définis dans un certain nombre de types de cellules, pourtant leur identification moléculaire a souffert de quelques faux départs bégayés. L’histoire concerne quatre types de protéines : les membres des familles de gènes CLCA, Bestrophin, Tweety et TMEM16. Dans tous les cas, leur surexpression recombinante a entraîné la génération de courants chlorure membranaires stimulés par l’augmentation de la concentration de calcium intracellulaire et, à des degrés divers, par la dépolarisation de la membrane. Le périple de CLCA a pris fin lorsqu’on a découvert qu’il s’agissait d’une protéine qui était sécrétée, mais qui était aussi susceptible de réguler à la hausse l’expression membranaire des canaux ClCa endogènes au système d’expression30. Les protéines Tweety et Bestrophin ne présentent pas toutes les propriétés des canaux ClCa étudiés dans les principaux tissus, bien que Best1 semble responsable d’une composante de ClCa dans les neurones sensoriels31 et peut également être un régulateur important de la libération de calcium du réticulum endoplasmique32,33. Trois études indépendantes ont proposé TMEM16A (également appelé Ano1) comme candidat pour un composant majeur, sinon dans son intégralité, pour un canal de chlorure activé par le calcium34-36. De nombreuses études ultérieures, facilitées par la génération d’outils moléculaires, ont confirmé cette hypothèse. TMEM16A est important pour la régulation de l’excitabilité de la membrane dans le muscle lisse vasculaire, il est régulé à la hausse dans un modèle animal d’hypertension pulmonaire et le tonus peut être réduit par l’inhibition du canal37,38. Dans les neurones sensoriels, TMEM16A couple la présence de médiateurs inflammatoires à l’hyperexcitabilité membranaire et l’inhibition de TMEM16A a des effets antinociceptifs39. Dans les modèles animaux d’asthme, l’expression de ce canal chlorure particulier est augmentée, et son inhibition peut avoir des effets bénéfiques40. On le trouve également dans les cellules interstitielles de Cajal de l’intestin et la fonction du canal est nécessaire à la contraction rythmique du muscle lisse de la paroi intestinale41. En outre, l’activation de TMEM16A pourrait constituer une voie alternative pour la sécrétion de chlorure épithélial dans la mucoviscidose42. Alors que la fonction précise du reste de la famille TMEM16 fait encore l’objet de débats, la fonction ClCa a également été attribuée à TMEM16B (Ano2), qui serait à la base du canal ClCa dans les cellules ciliées olfactives43,44. Il peut également y avoir des rôles pour cette classe de canal ionique dans la biologie des cellules cancéreuses et son inhibition peut empêcher la prolifération cellulaire45-48.

Marques finales

Cette revue a mis en évidence les divers rôles des protéines conductrices ou transporteuses de chlorure et comment leur dysfonctionnement est couplé à des troubles humains ou à des symptômes semblables à ceux des maladies dans les modèles animaux. Il existe un manque important de réactifs pharmacologiques qui inhibent, activent ou améliorent le trafic membranaire des canaux et transporteurs de chlorure. Des progrès sont réalisés avec des médicaments qui inversent la fonction défectueuse du CFTR dans la mucoviscidose, ce qui devrait permettre de mettre au point des médicaments spécifiques aux différents types de mutation héréditaire. Les inhibiteurs et les activateurs des canaux chlorure activés par le calcium TMEM16A42,49 s’avèrent être des outils de laboratoire utiles et de nouveaux composés pourraient constituer des médicaments efficaces, en particulier s’ils peuvent produire des effets spécifiques aux tissus. Les molécules spécifiques à des CLC particuliers sont probablement les plus insaisissables. La compréhension de la base structurelle de l’activation des CLC voltage-dépendants50 pourrait permettre d’identifier les domaines protéiques qui peuvent être ciblés par la conception rationnelle de médicaments basée sur la structure. De tels outils nous permettront de mettre à l’épreuve certaines des nouvelles idées thérapeutiques qui ont été examinées et présentées ici.

Biographie de l’auteur

Le Dr Jon Lippiat a terminé son doctorat sur la structure, la fonction et la pharmacologie des canaux potassiques à l’Université de Leicester. Il a étudié la fonction des cellules bêta pancréatiques et le diabète à l’Université d’Oxford avant d’être nommé maître de conférences en pharmacologie à l’Université de Leeds. Ses recherches portent sur l’élucidation des propriétés structurelles et physiologiques de plusieurs types différents de canaux et de transporteurs ioniques et sur leur ciblage potentiel par de nouveaux réactifs pharmacologiques.