La capacité de démontrer une corrélation entre une paire de biomolécules a été grandement améliorée par Erik Manders de l’Université d’Amsterdam qui a introduit le coefficient de corrélation de Pearson aux microscopistes, ainsi que d’autres coefficients dont les « coefficients de chevauchement » M1 et M2 se sont avérés les plus populaires et les plus utiles. Le but de l’utilisation de ces coefficients est de caractériser le degré de chevauchement entre les images, généralement deux canaux dans une image de microscopie multidimensionnelle enregistrée à différentes longueurs d’onde d’émission. Une approche populaire a été introduite par Sylvain Costes, qui a utilisé le coefficient de corrélation de Pearson comme outil pour fixer les seuils requis par M1 et M2 de manière objective. L’approche de Costes part du principe que seules les corrélations positives sont intéressantes, et ne fournit pas une mesure utile de la PCC.
Bien que l’utilisation de coefficients puisse améliorer de manière significative la fiabilité de la détection de la colocalisation, elle dépend d’un certain nombre de facteurs, notamment des conditions de préparation des échantillons fluorescents et de l’acquisition et du traitement des images de colocalisation. Les études doivent être menées avec une grande prudence, et après une lecture attentive du contexte. À l’heure actuelle, la confusion règne dans ce domaine et une approche normalisée n’a pas encore été fermement établie. Les tentatives pour y remédier comprennent le réexamen et la révision de certains coefficients, l’application d’un facteur de correction du bruit, « Replicate based noise corrected correlations for accurate measurements of colocalization ». et la proposition de nouveaux protocoles, qui ont été soigneusement examinés par Bolte et Cordelieres (2006). En outre, en raison de la tendance des images de fluorescence à contenir une certaine quantité de signal hors foyer, de bruit de poisson et d’autres bruits, elles doivent généralement être prétraitées avant d’être quantifiées. Une restauration soigneuse des images par déconvolution permet d’éliminer le bruit et d’augmenter le contraste des images, ce qui améliore la qualité des résultats de l’analyse de la colocalisation. Jusqu’à présent, les méthodes les plus fréquemment utilisées pour quantifier la colocalisation calculent la corrélation statistique des intensités des pixels dans deux canaux microscopiques distincts. Des études plus récentes ont montré que cela peut conduire à des coefficients de corrélation élevés, même pour des cibles dont on sait qu’elles résident dans des compartiments cellulaires différents. Une quantification plus robuste de la colocalisation peut être obtenue en combinant la reconnaissance numérique des objets, le calcul de la zone de chevauchement et la combinaison avec une valeur de corrélation entre l’intensité des pixels. Cela a conduit au concept d’un coefficient de corrélation de Pearson corrigé en fonction de l’objet.