Les méthyltransférases d’ADN (MTases) qui transfèrent un groupe méthyle de la S-adénosylméthionine aux résidus adénine ou cytosine, se trouvent dans une grande variété de procaryotes et d’eucaryotes. La méthylation doit être prise en compte lors de la digestion de l’ADN avec des endonucléases de restriction, car le clivage peut être bloqué ou altéré lorsqu’une base particulière du site de reconnaissance est méthylée.
Méthylation procaryote
Chez les procaryotes, les MTases ont le plus souvent été identifiées comme des éléments de systèmes de restriction/modification qui agissent pour protéger l’ADN hôte du clivage par l’endonucléase de restriction correspondante. La plupart des souches de laboratoire d’E. coli contiennent trois ADN méthylases spécifiques de site.
- Dam méthylase-méthylation en position N6 de l’adénine dans la séquence GATC (1,2).
- Dcm méthyltransférases-méthylation en position C5 de la seconde cytosine dans les séquences CCAGG et CCTGG (1,3).
- Méthylase EcoKI-méthylation de l’adénine dans les séquences AAC(N6)GTGC et GCAC(N6)GTT.
Certains ou tous les sites pour une endonucléase de restriction peuvent être résistants au clivage lorsqu’ils sont isolés à partir de souches exprimant les méthylases Dam ou Dcm si le site de reconnaissance de la méthylase chevauche le site de reconnaissance de l’endonucléase. Par exemple, l’ADN plasmidique isolé de E. coli dam+ est complètement résistant au clivage par MboI, qui clive les sites GATC.
Tous les ADN isolés de E. coli ne sont pas méthylés dans la même mesure. Alors que l’ADN pBR322 est entièrement modifié (et est donc complètement résistant à la digestion par MboI), seulement environ 50% des sites λ DNA Dam sont méthylés, probablement parce que la méthylase n’a pas l’occasion de méthyler entièrement l’ADN avant qu’il ne soit emballé dans la tête du phage. Par conséquent, les enzymes bloquées par la modification de Dam ou de Dcm donneront des modèles de digestion partielle avec l’ADN λ.
Les sites de restriction qui sont bloqués par la méthylation de Dam ou de Dcm peuvent être déméthylés en clonant votre ADN dans une souche dam-, dcm- de E. coli, comme E. coli compétent dam-/dcm- (NEB #C2925).
Les sites de restriction peuvent également être bloqués si un site de chevauchement est présent. Dans ce cas, une partie de la séquence Dam ou Dcm est générée par la séquence de l’enzyme de restriction, suivie de la séquence flanquante. Cette situation doit également être prise en compte lors de la conception des digests d’enzymes de restriction.
Méthylation eucaryote
Les MTases CpG, présentes chez les eucaryotes supérieurs (par exemple, Dnmt1), transfèrent un groupe méthyle à la position C5 des résidus cytosine. Les modèles de méthylation des CpG sont héréditaires, spécifiques des tissus et en corrélation avec l’expression des gènes. Par conséquent, il a été postulé que la méthylation CpG joue un rôle dans la différenciation et l’expression des gènes (4).
Note : Les effets de la méthylation CpG sont principalement une préoccupation lors de la digestion de l’ADN génomique eucaryote. Les schémas de méthylation CpG ne sont pas conservés une fois que l’ADN est cloné dans un hôte bactérien.
Sensibilité à la méthylation
Le tableau ci-dessous résume la sensibilité à la méthylation pour les enzymes de restriction NEB, indiquant si le clivage est bloqué ou altéré par la méthylation Dam, Dcm ou CpG si ou quand elle chevauche chaque site de reconnaissance. Ce tableau doit être considéré comme un guide du comportement des enzymes répertoriées plutôt que comme un indicateur absolu. Consultez REBASE , la base de données des enzymes de restriction, pour des informations plus détaillées et des exemples spécifiques sur lesquels ces directives sont basées.
- Marinus, M.G. et Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID : 4576399
- Geier, G.E.et Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID : 368070
- May, M.S. et Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID : 1097428
- Siegfried, Z. et Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID : 9115385
Légende
| ● | Non sensible | ◆ | Impuissant. |
| ◼ | Bloqué | ◇ ol | Impacté par le chevauchement |
| ◻ ol | Bloqué par le recouvrement | ◇ scol | Bloqué par certaines combinaisons de recouvrement |
| ◻ scol | Bloqué par certaines combinaisons de recouvrement | ||
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