Le premier travail de Johnstone a été avec Noel Murphy en 1968, où il a reçu son premier crédit d’album sur l’album Another Round. En 1969, Johnstone a obtenu un travail régulier en tant que musicien de session, où il a commencé à se diversifier et à explorer différents genres de musique, et à expérimenter avec une variété d’instruments. En 1970, lorsque Lyell Tranter (l’un des deux guitaristes du groupe de folk acoustique britannique Magna Carta) quitte le groupe, Johnstone prend sa place en tant que membre. Il a enregistré plusieurs albums avec eux en commençant par Seasons (1970), et a continué à contribuer à Songs from Wasties Orchard (1971) (du nom de la rue où il vivait à Long Hanborough, Oxfordshire), et à un album live intitulé In Concert.
Pendant son passage avec Magna Carta, Johnstone a joué d’une grande variété d’instruments, dont la guitare, la mandoline, le sitar et le dulcimer. Il a également attiré l’attention du producteur Gus Dudgeon à cette époque – Dudgeon demandant à Johnstone de jouer sur l’album solo éponyme de Bernie Taupin en 1971, ce qui a entraîné une rencontre avec Elton John et, finalement, le jeu de Johnstone sur l’album Madman Across the Water de John en 1971, après quoi il a été invité à rejoindre le groupe d’Elton John en tant que membre à part entière. Auparavant, le groupe d’Elton John était composé de John lui-même, du bassiste Dee Murray et du batteur Nigel Olsson.
Le premier album de Johnstone avec Elton John en tant que membre à part entière de son groupe était Honky Chateau, sur lequel il jouait des guitares électriques et acoustiques, de la guitare slide, du banjo et de la mandoline, et chantait également des chœurs aux côtés de Murray et Olsson.
En 1972, il travaille avec Joan Armatrading et Pam Nestor sur leur premier album Whatever’s for Us produit par Gus Dudgeon, jouant de la guitare acoustique et électrique sur plusieurs morceaux, et du sitar sur la chanson « Visionary Mountains ».
Johnstone a sorti un album solo, Smiling Face, en 1973 par The Rocket Record Company et a créé un groupe éphémère appelé China qui a sorti un album éponyme en 1977.
Même en jouant aux côtés d’autres artistes tels que Stevie Nicks, Meat Loaf et Alice Cooper à la fin des années 1970 et au début des années 1980, Johnstone n’a jamais été très éloigné des projets d’Elton et, suite à sa réunion avec ses compagnons d’origine Nigel Olsson et Dee Murray à plein temps pour la tournée « Jump Up » de 1982, il a rarement été absent d’un titre d’album ou d’une tournée d’Elton John.
En 1990, Johnstone a collaboré pour la première fois avec le parolier Steve Trudell. Avec la musique et le texte en place, les deux ont formé Warpipes, qui comprenait les anciens et actuels membres du groupe Elton John Nigel Olsson à la batterie, Bob Birch à la basse, Guy Babylon aux claviers, ainsi que Billy Trudel comme vocaliste. En 1991, Warpipes a sorti son seul album, Holes in the Heavens, sur le label Artful Balance Records. Lorsque Artful Balance Records a fermé ses portes, cet album a été réédité sur Bridge Recordings. Le titre de l’album a été changé pour devenir simplement « Warpipes » et la composition des chansons a été légèrement modifiée.
En 1991, Johnstone a produit Stormy Blue d’Addison Steel dans lequel il jouait de la guitare, de la mandoline, du sitar et du banjo, et interprétait le chant. Le coproducteur Guy Babylon l’a rejoint avec des arrangements de clavier, aux côtés du batteur Nigel Olsson et de Billy Trudell ajoutant respectivement des percussions et du chant.
En 1996, Johnstone a publié une vidéo d’instruction de guitare intitulée Davey Johnstone : Star Licks Master Sessions pour Star Licks Productions, dans laquelle il joue une grande variété de classiques de John, rejoint par Billy Trudel au chant et Bob Birch à la basse.
En 1997, alors qu’ils étaient en tournée avec John, Johnstone et John Jorgenson, alors membre du groupe Elton John et ancien guitariste des Hellecasters, ont passé une grande partie de leur temps libre à créer Crop Circles, un album d’instrumentation acoustique sorti en 1998.
Le 10 juin 2009, Johnstone a joué un historique 2000e spectacle en tant que membre du groupe Elton John au SECC de Glasgow, en Écosse. Il sert actuellement de directeur musical de John, en plus de son travail de guitariste, jouant avec Nigel Olsson et John Mahon ; il a également joué avec Bob Birch avant la mort de ce dernier en août 2012.
En 2014, il a joué sur « Belle Fleur » et « If You Were My Love » de l’album 24 Karat Gold de Stevie Nicks : Songs from the Vault. Il connaissait Nicks pour avoir joué de la guitare sur plusieurs chansons de son album Bella Donna de 1981.
Le 1er octobre 2019, Johnstone a donné son 3000e spectacle avec Elton John lors du premier des deux arrêts de la tournée Farewell Yellow Brick Road au SaskTel Centre de Saskatoon, en Saskatchewan.