La méthode Sanger est utilisée pour amplifier un segment cible d’ADN, afin de pouvoir déterminer précisément la séquence d’ADN. L’incorporation de ddNTP dans les valves de réaction sert simplement à mettre fin à la synthèse d’un brin d’ADN en croissance, ce qui donne des fragments d’ADN partiellement répliqués. En effet, l’ADN polymérase a besoin du groupe OH 3′ de la chaîne en croissance et du groupe phosphate 5′ du dNTP entrant pour créer une liaison phosphodiester. Parfois, l’ADN polymérase incorpore un ddNTP et l’absence du groupe 3′ OH interrompt la réaction de condensation entre le phosphate 5′ (suite au clivage du pyrophospate) du nucléotide entrant et le groupe hydroxyle 3′ du nucléotide précédent sur le brin en croissance. Cette réaction de condensation se produit normalement lors de l’incorporation d’un dNTP non modifié par l’ADN polymérase. En termes simples, l’attaque nucléophile du groupe OH 3′ entraîne l’addition d’un nucléotide sur une chaîne en croissance. L’absence du groupe hydroxyle 3′ empêche cette attaque nucléophile de se produire, désactivant la capacité des ADN polymérases à poursuivre leur fonction.
Cette découverte a conduit à son nom approprié « nucléotides terminateurs de chaîne ». Les didésoxyribonucléotides n’ont pas de groupe hydroxyle 3′, donc aucune autre élongation de la chaîne ne peut se produire une fois que ce didésoxynucléotide est sur la chaîne. Cela peut conduire à la terminaison de la séquence d’ADN. Ainsi, ces molécules constituent la base de la méthode de séquençage de l’ADN par terminaison de la chaîne de didésoxy, qui a été présentée par Frederick Sanger et son équipe en 1977 comme une extension de travaux antérieurs. L’approche de Sanger a été décrite en 2001 comme l’une des deux méthodes fondamentales de séquençage des fragments d’ADN (l’autre étant la méthode Maxam-Gilbert), mais la méthode de Sanger est à la fois « la plus répandue et la méthode utilisée par la plupart des séquenceurs automatiques d’ADN ». Sanger a reçu son deuxième prix Nobel de chimie en 1980, le partageant avec Walter Gilbert (« pour leurs contributions concernant la détermination des séquences de bases dans les acides nucléiques ») et avec Paul Berg (« pour ses études fondamentales de la biochimie des acides nucléiques, en particulier en ce qui concerne l’ADN recombinant »), et a discuté de l’utilisation des didésoxynucléotides dans sa conférence Nobel.
Séquençage de l’ADNEdit
Les didésoxynucléotides sont utiles dans le séquençage de l’ADN en combinaison avec l’électrophorèse. Un échantillon d’ADN qui subit une PCR (réaction en chaîne par polymérase) dans un mélange contenant les quatre désoxynucléotides et un didésoxynucléotide produira des brins de longueur égale à la position de chaque base du type qui complète le type ayant un didésoxynucléotide présent. La taq polymérase utilisée dans la PCR favorise le ddGNTP, ce qui a été un modèle observé dans diverses recherches. C’est-à-dire que chaque base nucléotidique de ce type particulier a une probabilité d’être liée non pas à un désoxynucléotide mais plutôt à un didésoxynucléotide, ce qui met fin à l’allongement de la chaîne. Par conséquent, si l’échantillon est ensuite soumis à une électrophorèse, il y aura une bande présente pour chaque longueur à laquelle le complément du didésoxynucléotide est présent. Il est maintenant courant d’utiliser des didésoxynucléotides fluorescents de telle sorte que chacun des quatre a une fluorescence différente qui peut être détectée par un séquenceur ; ainsi, une seule réaction est nécessaire.
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