Enzymes antioxydantes, indices inflammatoires et facteurs liés au mode de vie chez les hommes âgés : une analyse de cohorte

Abstract

Nous avons examiné la relation entre les activités des enzymes antioxydantes sanguines, les indices du statut inflammatoire et un certain nombre de facteurs liés au mode de vie dans l’étude de cohorte prospective de Caerphilly sur les cardiopathies ischémiques. L’étude a débuté en 1979 et est basée sur un échantillon représentatif de la population masculine. Au départ, 2512 hommes ont été examinés dans la phase I, puis suivis tous les 5 ans dans les phases II et III ; ils ont récemment été examinés dans la phase IV. Des données sur la classe sociale, l’habitude de fumer, la consommation d’alcool ont été obtenues par questionnaire, et l’indice de masse corporelle a été mesuré. Les activités des enzymes antioxydantes et les indices du statut inflammatoire ont été estimés par des techniques standard. Des associations significatives ont été observées pour : l’âge avec l’α-1-antichymotrypsine (p<0,0001) et avec la caeruloplasmine, à la fois protéine et oxydase (p<0,0001) ; l’habitude de fumer avec l’α-1-antichymotrypsine (p<0,0001), avec la caeruloplasmine, à la fois protéine et oxydase (p<0,0001) et avec le glutathion peroxydose (GPX) (p<0.0001) ; la classe sociale avec l’α-1-antichymotrypsine (p<0,0001), avec la céruloplasmine, à la fois la protéine (p<0,001) et l’oxydase (p<0,01) et avec le GPX (p<0,0001) ; l’indice de masse corporelle avec l’α-1-antichymotrypsine (p<0,0001) et avec la protéine de céruloplasmine (p<0,001). Il n’y avait pas d’association significative entre la consommation d’alcool et l’une des enzymes sanguines mesurées. L’analyse factorielle a produit un modèle à trois facteurs (expliquant 65,9 % de la variation de l’ensemble des données) qui semblait indiquer des interrelations étroites entre les antioxydants.

Introduction

Les cardiopathies ischémiques continuent d’être une cause majeure de décès en Europe et aux États-Unis1. Ces dernières années, le rôle pathologique des radicaux libres dans le développement de l’athérosclérose a suscité un grand intérêt.2-5 L’organisme a développé une stratégie de défense complexe pour minimiser les effets néfastes de divers oxydants. Les enzymes antioxydantes du sang sont au cœur de cette défense. Il s’agit de la superoxyde dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), de la glutathion peroxydase (GPX, EC 1.11.1.9), de la catalase (EC 1.11.1.6) et de la caeruloplasmine, qui agissent de concert pour protéger l’organisme des dommages oxydatifs6. La superoxyde dismutase érythrocytaire est dépendante du cuivre (bien que le zinc ait un rôle structurel) et accélère la dismutation du superoxyde O2- en H2O2 et O2.7 L’enzyme glutathion peroxydase, qui contient du sélénium, détoxifie le H2O2 en utilisant le glutathion réduit (GSH) et le H2O2 comme substrats pour produire du H2O et du glutathion oxydé (GSSG);8 le GSSG, à son tour, est réduit en GSH par l’enzyme glutathion réductase qui nécessite du NADPH comme réducteur ; ce dernier est fourni par l’enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PDH, EC 1.1.1.49). La catalase est une grande enzyme contenant du fer lié à l’hème sur ses sites actifs. Elle élimine le H2O2 en le décomposant directement en O2.9 Dans le plasma, la caeruloplasmine (oxydase) agit comme un antioxydant important dans la protection de l’organisme contre le stress oxydatif. Cette dernière enzyme, ainsi que l’alpha-1-antichymotrypsine, est également un réactif en phase aiguë et peut être utilisée pour indiquer l’état inflammatoire.

Les preuves accumulées suggèrent que les altérations ou les perturbations de ces systèmes enzymatiques défensifs peuvent contribuer au développement de l’athérosclérose ou l’exacerber.10-12 D’autres études examinant l’effet du vieillissement sur les activités enzymatiques antioxydantes du myocarde et la peroxydation lipidique chez le rat ont montré que la capacité antioxydante du myocarde est affaiblie au cours du vieillissement, ce qui augmente la possibilité de dommages oxydatifs13. Chez l’homme, il a été démontré que le tabagisme, un facteur de risque majeur d’athérosclérose, déprime l’activité de la glutathion peroxydase plasmatique.14 Les auteurs de l’étude affirment que cette découverte est cohérente avec l’idée que les fumeurs sont soumis à une charge oxydative soutenue, et qu’un statut antioxydant inadéquat combiné à la charge accrue en radicaux libres causée par le tabagisme, peut exacerber l’oxydation des LDL et augmenter leurs propriétés athérogènes. Cela peut être particulièrement vrai dans une population présentant un risque élevé de maladie coronarienne. Une diminution de l’activité de la glutathion peroxydase, de la superoxyde dismutase et de la catalase a également été observée dans les plaquettes des personnes atteintes de maladie coronarienne,15 et chez les personnes ayant subi un infarctus aigu du myocarde.16-17

La plupart des études examinant l’activité des enzymes antioxydantes et les maladies cardiaques ont porté sur des sujets hautement sélectionnés, utilisant des échantillons relativement petits. L’étude de cohorte prospective de Caerphilly sur les cardiopathies ischémiques, les accidents vasculaires cérébraux et le déclin cognitif, a donné l’occasion d’étudier les activités des enzymes antioxydantes sanguines dans un échantillon représentatif de la population masculine et d’explorer les interrelations possibles entre les activités des enzymes antioxydantes, l’âge, la classe sociale, l’habitude de fumer et la consommation d’alcool.

Méthodes

Une description complète de la cohorte de Caerphilly et de la collecte de données relatives aux maladies cardiaques, aux accidents vasculaires cérébraux et à d’autres conditions a été donnée ailleurs;18-21 seule une brève description est présentée ici. Au départ, 2512 hommes ont été examinés lors de la phase I (1979-1983), alors qu’ils étaient âgés de 45 à 59 ans. Les hommes ont ensuite été suivis après chaque période de 5 ans (dans les phases II et III) et ont récemment été examinés dans la phase IV. Lorsque les hommes étaient âgés de 55 à 69 ans (phase III), des échantillons de sang à jeun ont été prélevés pour l’estimation des vitamines et des enzymes antioxydantes dans le sang. Malheureusement, les examens des hommes avaient commencé quelques mois avant que l’opportunité de ces estimations ne se présente et le sang de quelques centaines d’hommes n’a pas été obtenu pour les estimations des antioxydants. Le plasma a été séparé des érythrocytes par centrifugation à faible vitesse, et les érythrocytes ont été lavés avec du sérum physiologique. Le plasma et les érythrocytes lavés ont été conservés à -70 °C avant l’analyse.

Les enzymes antioxydantes ont été estimées par des méthodes standard comme suit . Les activités de la superoxyde dismutase, de la glutathion peroxydase et de la glucose-6-phosphate déshydrogénase ont été estimées sur un auto-analyseur Cobas Fara en utilisant des kits disponibles dans le commerce fournis par Randox Laboratories. L’activité catalase érythrocytaire a été estimée par la méthode d’Aebi22 en utilisant un spectromètre Varian Cary 1. L’hémoglobine érythrocytaire (Hb) a été mesurée par une modification de la méthode décrite par Dacie et Lewis23 en utilisant un hémoglobinomètre dédié (Coulter Electronics). Le dosage a été étalonné à l’aide de l’étalon cyanméthémoglobine (HiCN), conforme à la norme B.S. 3985 (BDH), comme recommandé par le fabricant. Les protéines de la phase aiguë, l’alpha-1-antichymotrypsine et la caeruloplasmine, ont été estimées à l’aide de méthodes immunoturbidométriques et de kits commerciaux fournis par Dako, à l’exception du fait que les aliquotes utilisées pour ces analyses ont été diluées manuellement, et non automatiquement, avant d’être dosées sur un auto-analyseur Cobas Fara. L’activité de la caéruloplasmine oxydase (CpO) a été estimée sur le Cobas Fara en utilisant le dichlorhydrate de p-phénylènediamine comme substrat.24 Les variations intra et inter-lots étaient <6,5 % pour tous les analytes mesurés.

Des données supplémentaires, y compris l’habitude de fumer, la classe sociale, la consommation d’alcool et l’indice de masse corporelle ont été recueillies par questionnaire et par mesure physique, respectivement ; tous les détails ont été décrits précédemment.19

Analyse statistique

La normalité des distributions des différents paramètres mesurés a été examinée à l’aide du test de Kolmogorov Smirnov. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes, médianes et écarts types (ET), ainsi que la moyenne et les fourchettes à 95% obtenues après transformation des données si nécessaire. Les interrelations entre les différents ensembles de données ont été examinées par corrélation, régression dans une matrice de corrélation et par analyse factorielle, et pour cela, les variables ont été transformées, généralement en logarithmes, afin d’obtenir une normalité ou une quasi-normalité, le cas échéant. Les analyses factorielles ont été effectuées pour tenter d’extraire un nombre relativement faible de facteurs ou de constructions sous-jacentes qui simplifieraient les interrelations des variables et faciliteraient ainsi la compréhension des processus complexes.

Résultats

La cohorte comptait 2154 hommes au moment des examens de la phase III (1989-1993). Des échantillons de sang à jeun ont été obtenus auprès de 1800 d’entre eux, soit 84% de la cohorte totale.

Les moyennes, médianes et écarts types pour les enzymes antioxydantes étudiées dans la cohorte d’hommes de Caerphilly sont présentés dans le tableau 1. Seules la SOD et la GPX se sont avérées être normalement distribuées. Les résultats sont présentés pour toutes les enzymes sous forme de données brutes et également après transformation logarithmique. Les interrelations (présentées sous forme de coefficients de corrélation) entre les différentes enzymes antioxydantes de la cohorte sont indiquées dans le tableau 2. Des corrélations significatives ont été observées entre un certain nombre de mesures, en particulier celles qui sont liées au statut inflammatoire, c’est-à-dire l’alpha-1-antichymotrypsine et la caeruloplasmine (protéine et oxydase). Les associations des niveaux d’enzymes sanguins ont également été comparées à un certain nombre de variables, notamment : l’âge, le tabagisme, la classe sociale, l’indice de masse corporelle et la consommation d’alcool. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Les données ont été examinées en tant que données brutes et normalisées pour tenir compte des effets possibles des facteurs de confusion. Aucune différence majeure n’a été constatée entre les deux. Par conséquent, seules les données standardisées sont présentées. Des associations significatives ont été observées pour : l’âge avec l’alpha-1-antichymotrypsine et avec la céruloplasmine, à la fois la protéine et l’oxydase ; le tabagisme avec l’alpha-1-antichymotrypsine, avec la céruloplasmine (protéine et oxydase) et avec la GPX ; la classe sociale avec l’alpha-1-antichymotrypsine, avec la céruloplasmine (protéine et oxydase) et avec la GPX ; l’indice de masse corporelle avec l’alpha-1-antichymotrypsine et avec la protéine de céruloplasmine. Aucune association significative n’a été observée entre la consommation d’alcool et l’une des enzymes sanguines mesurées.

Lorsque l’analyse factorielle a été appliquée aux sept variables plasmatiques (n=1689), deux facteurs communs ont été dérivés avec des valeurs propres de 2,24 et 1,40, qui expliquent ensemble 52,1% de la variation totale de l’ensemble des données. Le facteur 1 explique 32,0 % de la variation totale de l’ensemble des données. Il était le plus étroitement associé à l’alpha-1-antichymotrypsine, à la protéine caeruloplasmine et à l’oxydase (et à un degré moindre à la SOD et à la catalase). Le facteur 2 explique 20,1 % de la variation totale. Il était le plus étroitement associé à la SOD, à la catalase, à la G-6-PDH et à la GPX.

Les mesures d’adéquation du modèle étaient adéquates, à l’exception notable des communalités faibles de trois des variables (0,42 pour la SOD, 0,34 pour la G-6-PDH, 0,18 pour la GPX) qui rendaient le modèle inacceptable.

Un modèle à trois facteurs a également été construit. Bien que le troisième facteur explique marginalement moins de la variation totale de l’ensemble des données qu’une variable individuelle ne le ferait, les communalités des variables (et d’autres mesures de l’adéquation du modèle) s’améliorent, indiquant que ce modèle fournit une description plus adaptée des interrelations entre les variables observées. Le facteur 3 explique encore 13,8% de la variation totale de l’ensemble des données, ce qui donne un total de 65,9% pour le modèle à trois facteurs. Le facteur 1 est toujours le plus étroitement associé à l’alpha-1-antichymotrypsine, à la protéine caeruloplasmine et à l’oxydase. Le facteur 2 est le plus étroitement associé à la SOD et à la catalase (et dans une bien moindre mesure à la G-6-PDH). Le facteur 3 est le plus étroitement associé à la GPX et à la G-6-PDH.

L’amélioration la plus frappante de l’adéquation du modèle à trois facteurs par rapport au modèle à deux facteurs est l’amélioration de la communalité de la GPX (de 0,18 à 0,78). Les communalités de la SOD et de la G-6-PDH se sont également améliorées (de 0,63 et 0,42). Il semblerait que la GPX ait un rôle particulier qui n’est pas contenu dans le modèle à trois facteurs.

Discussion

La cohorte d’hommes de Caerphilly a été largement étudiée depuis le début du projet en 1979.25-29 L’une des forces des données actuelles est qu’elles proviennent d’un échantillon de population représentatif. Caerphilly, dans le sud du Pays de Galles, est une zone industrielle/résidentielle typique, bien que la distribution des classes sociales suggère qu’il pourrait y avoir un certain biais vers les professions manuelles. L’objectif de la présente étude était d’obtenir des statistiques descriptives et d’examiner les interrelations possibles entre les activités des enzymes antioxydantes dans le sang, en utilisant l’analyse factorielle comme technique de réduction des données et de création d’hypothèses. En outre, les relations possibles entre les enzymes antioxydantes et un certain nombre de variables liées au mode de vie ont été étudiées. Bien qu’il n’existe actuellement aucune gamme de référence définitive pour les enzymes antioxydantes SOD, GPX et catalase, les résultats ont d’abord été comparés aux données publiées précédemment avant que les relations possibles entre les enzymes antioxydantes et les facteurs liés au mode de vie ne soient explorées.

L’activité SOD est quantifiée indirectement dans un échantillon par la capacité de cet échantillon à réduire le flux de radicaux libres détecté. Les activités SOD varient entre les systèmes de dosage, et les fabricants de kits ne recommandent donc pas de plages de référence. Cependant, les données obtenues sur l’échantillon de Caerphilly sont comparables aux résultats publiés précédemment à l’aide du même kit d’analyse.30 Les activités de la GPX peuvent également varier au sein d’un même système de dosage et entre les systèmes. On pense que la GPX oxydée est susceptible d’être désactivée par le cyanure, qui est contenu dans le réactif de Drabkins utilisé pour stabiliser l’hémoglobine dans les échantillons et empêcher d’autres réactions enzymatiques de se produire.31 Ce problème a été résolu par l’ajout de dithiothreitol/dithionite dans le tampon de dilution. Les résultats de la cohorte de Caerphilly (38,0±11,0SD UI/g Hb) sont similaires à ceux d’une étude récemment publiée (36,1±6,5 UI/g Hb).32 Cette dernière étude, cependant, était basée sur un très petit nombre (n=10) de patients ayant subi un infarctus du myocarde. Les activités moyennes de la catalase dans la cohorte de Caerphilly étaient comparables à celles d’une étude antérieure30, bien que beaucoup plus petite, réalisée par notre laboratoire sur un groupe d’hommes âgés de 50 à 54 ans (52,9±17,1 cf. 49,0±20 K/g Hb respectivement, n=18), qui présentaient à leur tour des activités de la catalase plus élevées qu’une étude beaucoup plus ancienne (de 31.3±9,6 K/g Hb).33 Le fabricant du kit G-6-PDH utilisé cite une valeur « normale » de 1,31±0,13 (moyenne±SD) U/g Hb qui est comparable aux résultats obtenus dans cette étude de 1,32±0,7 U/g Hb.

Les protéines de la phase aiguë sont des marqueurs de la maladie. Celles mesurées dans cette étude sont connues comme des protéines de phase aiguë positives (c’est-à-dire qu’elles augmentent dans les états pathologiques). Les taux moyens d’alpha-1-antichymotrypsine et de céruloplasmine (protéine) se situaient tous deux dans les fourchettes de référence34 précédemment établies de 0,3-0,6 et 0,15-0,6 g/l, respectivement. Ils étaient également comparables à ceux d’une cohorte de la branche britannique de l’étude EPIC35, tandis que les activités de la caéruloplasmine oxydase étaient similaires à celles d’une étude de 1994.36 Le tableau 3 montre que, dans l’ensemble, les enzymes antioxydantes sanguines ont peu changé avec l’âge. Comme prévu, les protéines de la phase aiguë (une mesure de l’état inflammatoire) étaient positivement associées à l’âge. Les deux protéines de la phase aiguë présentaient des associations positives significatives avec l’habitude de fumer. Seule la GPX a montré une association significative (négative) avec l’habitude de fumer. Il a été démontré précédemment que les activités GPX érythrocytaires étaient plus faibles chez les fumeurs que chez les non-fumeurs,37 reflétant très probablement le stress oxydatif accru que l’on pense se produire dans ce groupe, en raison des radicaux libres présents dans la fumée.38 Les résultats concernant la classe sociale ont montré une tendance à l’augmentation de l’état inflammatoire (tel que jugé par l’augmentation des niveaux de protéines de phase aiguë), avec la diminution de la classe sociale. La GPX a été la seule enzyme à présenter une association significative avec la classe sociale, les activités étant réduites dans le groupe manuel. L’IMC présentait une tendance similaire à celle des autres facteurs de mode de vie examinés, mais les associations n’étaient pas aussi fortes. Les tendances et les associations observées pour les classes sociales inférieures n’étaient pas inattendues, les circonstances environnementales et les facteurs liés au mode de vie tels que le tabagisme, le régime alimentaire, etc. contribuant probablement à des niveaux plus élevés d’inflammation et à des IMC plus élevés.

L’analyse factorielle des données a produit un modèle à trois facteurs qui explique 65,9 % de la variation de l’ensemble des données. Un certain nombre d’aspects intéressants ont été révélés par l’analyse factorielle. Le facteur 1 du modèle rassemble trois mesures qui sont liées par des mécanismes inflammatoires. Le facteur 2 comprend deux antioxydants « courants », à savoir la SOD et la catalase. L’observation selon laquelle le facteur 3 est le plus étroitement associé à la GPX et à la G-6-PDH correspond à ce qui serait prédit par la théorie, car cette dernière enzyme produit des cofacteurs réduits pour la réduction du glutathion qui, à son tour, peut être utilisé par la première enzyme. Des preuves indiquent que le glucose-6-phosphate est une molécule centrale dans le métabolisme cellulaire du glucose qui influence de façon critique l’activité du cycle du pentose phosphate et, via la génération de NADPH, régule l’activité GPX pour la détoxification des radicaux et aussi la synthèse du cholestérol et des triglycérides.39

L’enzyme Cu Zn SOD convertit O2– en H2O2. La GPX érythrocytaire peut éliminer H2O2 à un taux élevé, et oxyde le GSH en GSSG. Le GSSG peut être réduit en GSH par le NADPH produit à partir du G-6-PD. La catalase a une plus grande capacité que la GPX à détruire le H2O2 (produit, entre autres, par l’explosion respiratoire des neutrophiles) en le décomposant directement en H2O ; en termes de molécules de H2O2 détruites par minute par molécule d’enzyme, c’est l’une des enzymes les plus actives connues. Cependant, son affinité pour l’H2O2 est également faible, et elle a besoin de concentrations élevées d’H2O2 pour une activité élevée, ne traitant que lentement l’H2O2 à de faibles concentrations.

La molécule d’H2O2 a la capacité de traverser facilement les membranes cellulaires et, si elle est produite de manière extracellulaire, peut se diffuser dans la cellule la plus proche (y compris les érythrocytes) pour être métabolisée par des enzymes antioxydantes. Par conséquent, les érythrocytes et d’autres types de cellules pourraient agir comme des « puits » de H2O2. Ce lien entre les mécanismes de défense antioxydants et les indices d’inflammation (ou de stress oxydatif) est peut-être ce qui est décrit dans le modèle à trois facteurs. Cela soutient le concept d’un système de défense antioxydant équilibré et coopératif dans le sang, qui dépend des niveaux optimaux d’un certain nombre de systèmes antioxydants plutôt que de la concentration ou de l’activité d’un seul antioxydant, mais n’exclut pas ou ne diminue pas l’importance d’antioxydants particuliers, dans des situations ou des conditions particulières.

En conclusion, les principaux résultats de cette étude sont que la caeruloplasmine (totale et oxydase) est augmentée chez les fumeurs uniquement dans les classes sociales inférieures. Les changements dans la caeruloplasmine se reflétaient dans les changements dans le réactif de phase aiguë alpha-1-antichymotrypsine, et étaient probablement liés à l’inflammation ou au statut de la maladie. La GPX était la seule enzyme antioxydante à changer significativement avec le mode de vie, augmentant avec l’âge, mais elle était plus faible chez les fumeurs et les personnes appartenant aux classes socio-économiques inférieures et ayant un IMC plus faible. Dans l’ensemble, ces résultats indiquent une diminution de la protection antioxydante parallèlement au stress oxydatif/inflammatoire. L’analyse factorielle a abouti à un modèle à trois facteurs expliquant 65,9 % de la variation de l’ensemble des données, ce qui semble indiquer des interrelations étroites entre les enzymes antioxydantes.