Sanes et Lichtman ont utilisé l’injection pronucléaire pour insérer ces constructions Brainbow dans des souris. Lorsqu’ils ont imagé les cerveaux des souris, ils ont trouvé beaucoup plus que 3-4 couleurs en raison de l’intégration en tandem de multiples copies de la construction (environ 8 chez les souris Brainbow-1.0.) L’effet combinatoire de multiples événements de recombinaison indépendants conduit à un arc-en-ciel de couleurs. Avec trois copies de la construction, on pourrait s’attendre à dix couleurs (voir le tableau à droite) ; dans divers rapports, Sanes et Lichtman ont observé de 90 à 160 couleurs distinctes en raison du nombre plus élevé de copies. Le nom de Brainbow est vraiment approprié pour cette technologie colorée.
Optimisation du système : Brainbow-3
Bien que Brainbow ait fourni aux neuroscientifiques le vaste éventail de couleurs nécessaires pour marquer les neurones individuels, le système a également souffert d’un certain nombre de limitations. Tout d’abord, l’imagerie des tissus de souris Brainbow était difficile en raison de la faible intensité de fluorescence, causée en partie par la photoinstabilité des fluorophores, ainsi que de la tendance des fluorophores à s’agréger dans le soma des neurones. Deuxièmement, le système ne permettait pas l’analyse par immunomarquage. Bien que les fluorophores utilisés soient distincts sur le plan de la fluorescence, leurs séquences protéiques sont hautement homologues, ce qui empêche la conception d’anticorps spécifiques à chaque fluorophore. Troisièmement, Brainbow-1 et Brainbow-2 contiennent chacun un état « par défaut » ; par exemple, Brainbow-1.0 exprime la RFP lorsque la construction n’a pas subi de recombinaison. Cet état par défaut était exprimé de manière disproportionnée par une majorité de neurones, ce qui limitait le nombre de couleurs distinctes pouvant être observées dans une zone donnée.
En 2013, Dawen Cai, et al. ont publié un perfectionnement de la technologie Brainbow, Brainbow-3.0, dans le but de surmonter les limites énumérées ci-dessus. Tout d’abord, ils ont passé au crible une variété de protéines fluorescentes pour trouver celles qui présentaient les caractéristiques idéales (faible agrégation, photostabilité élevée et grande stabilité après fixation). Parmi les sept protéines obtenues, ils en ont choisi trois présentant de faibles niveaux de fluorescence et de chevauchement de séquences (mOrange2 de corail, EGFP de méduse et mKate2 d’anémone de mer). Ils ont ensuite généré avec succès des anticorps personnalisés pour chacune de ces protéines et confirmé l’absence de réactivité croisée, ouvrant ainsi la voie à l’analyse par immunomarquage. Pour obtenir un marquage cellulaire uniforme, ils ont généré des dérivés farnésylés des protéines fluorescentes, qui sont directement acheminés vers les membranes cellulaires. Le trafic membranaire des dérivés farnesylés permet le marquage des processus axonaux et dendritiques délicats qui n’étaient pas visibles auparavant avec Brainbow-1 et -2.
La structure générale de Brainbow-1.0 est conservée dans Brainbow-3.0, mais avec mOrange2, EGFP et mKate2 comme fluorophores ; mOrange2 est l’état par défaut. En revanche, Brainbow-3.1 et -3.2 ne présentent pas de fluorescence par défaut en raison de l’ajout d’une cassette STOP bloquant la traduction immédiatement après le promoteur. La cassette STOP comprend une YFP mutante qui n’est pas fluorescente, mais qui peut être détectée par immunocoloration. Cette caractéristique facilite le dépistage des souris Brainbow Cre-négatives afin de déterminer le nombre et le type de cellules dans lesquelles la construction est exprimée. La photostabilité de Brainbow-3.2 est améliorée grâce à l’ajout d’un élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l’hépatite de la marmotte (WPRE), couramment utilisé pour augmenter les niveaux de protéines du transgène.
Variantes de Brainbow et applications au-delà du cerveau de la souris
En plus d’améliorer le système Brainbow, Sanes et Lichtman ont également développé une construction Flpbow complémentaire qui est fonctionnellement similaire à Brainbow basée sur Cre, mais qui est contrôlée par la recombinase FLP/FRT. Lorsqu’elles sont placées sous différents promoteurs, Brainbow et Flpbow peuvent être utilisées pour marquer des populations cellulaires distinctes.
Pour diminuer la reproduction animale nécessaire pour produire des animaux avec des transgènes Brainbow et Cre, Cai et al. ont également créé une construction Autobow contenant à la fois Cre et XFP. La production de Cre entraîne la recombinaison et la sélection des XFP, puis l’auto-excision de Cre. Ces constructions sont maintenues de manière stable pendant au moins six générations.
En plus des constructions neuronales pThy1-Brainbow, Addgene dispose également de deux vecteurs viraux adéno-associés (AAV) Brainbow – AAV-EF1a-BbChT et AAV-EF1a-BbTagBY. Ces constructions contiennent chacune deux XFP en raison des limites de taille associées aux AAV ; la co-infection avec les deux constructions produit un minimum de 8 couleurs. L’utilisation de l’AAV permet un contrôle spatial et temporel sans qu’il soit nécessaire de modifier la lignée germinale, et permet d’utiliser Brainbow chez une variété d’espèces.
D’autres variantes ont été créées par d’autres laboratoires, notamment R26R-Confetti décrite dans Hugo J. Snippert, et al. (2010) et la stratégie du marqueur MAGIC décrite dans Karine Loulier, et al. (2014).
En ce moment, les techniques Brainbow sont également appliquées pour étudier des organismes modèles tels que la drosophile et le poisson zèbre. Chez la drosophile, Brainbow a aidé à la cartographie des circuits neuronaux, tels que les connexions entre les neurones moteurs et la jonction neuromusculaire. Chez le poisson zèbre, la méthode est devenue très utile pour le traçage des lignées ; « Zebrabow » a été utilisé pour retracer le développement de l’épithélium cornéen.
Pour les scientifiques intéressés par les neurosciences et le développement, Brainbow est un outil précieux pour marquer et suivre des cellules uniques en raison du large éventail et de la grande stabilité des couleurs. Sanes et Lichtman estiment que l’étiquetage coloré de Brainbow a diminué le temps de cartographie pour une section donnée du cerveau d’au moins un ordre de grandeur. Il est clair que de nouveaux perfectionnements de la technique Brainbow fourniront des informations importantes sur l’organisation physique complexe du cerveau et d’autres systèmes biologiques.
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Stratégies transgéniques pour l’expression combinatoire de protéines fluorescentes dans le système nerveux. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
Une approche technicolor du connectome. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi : 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
L’homéostasie de la crypte intestinale résulte d’une compétition neutre entre les cellules souches Lgr5 se divisant symétriquement. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow : une technique de marquage par fluorescence basée sur la recombinase pour subdiviser les modèles d’expression neuronale. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi : 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow : étiquetage cellulaire multicolore génétique pour l’analyse des circuits neuronaux chez Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi : 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Des outils améliorés pour la boîte à outils Brainbow. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi : 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow : marquage cellulaire multispectral pour le traçage cellulaire et l’analyse de la lignée chez le poisson zèbre. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Développement. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi : 10.1242/dev.094631. PubMed.
Pistage multiple des cellules et des lignées avec des étiquettes combinatoires. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
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