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Les virus grippaux humains infectent généralement le système respiratoire supérieur, provoquant des éternuements, un écoulement nasal et une toux, ainsi que de la fièvre, des malaises et des arthralgies (22). En outre, des complications neurologiques ont également été signalées lorsqu’un nouveau sous-type de virus de la grippe est introduit dans la population humaine, comme l’illustrent les pandémies espagnole (1918) et asiatique (1957) (2-4, 6, 10, 18, 22).
En 1997, le virus de la grippe H5N1, originaire de la volaille, a provoqué une épidémie chez l’homme. Depuis lors, plus de 500 personnes ont été infectées par des virus H5N1 dans le monde, avec un taux de mortalité d’environ 60 % (21). L’infection humaine par le virus H5N1 se manifeste généralement par une pneumonie sévère, qui évolue vers un syndrome de détresse respiratoire aiguë ; toutefois, certaines victimes du virus H5N1 ont présenté une atteinte neurologique (1). L’ARN et les antigènes du virus H5N1 ont été détectés dans le cerveau des patients, et le virus lui-même a été isolé du liquide céphalo-rachidien (5, 7) Ces données suggèrent que certains virus H5N1 pourraient provoquer une encéphalite chez l’homme, comme cela s’est produit dans les premières phases des pandémies espagnole et asiatique.
Les furets représentent un modèle mammifère utile de l’infection grippale car ils sont très sensibles à l’infection par les virus grippaux et développent certains des symptômes de la grippe qui sont observés chez l’homme (8, 12, 14, 16, 19). La neuro-invasion d’un virus grippal H5N1 après une exposition intranasale a également été rapportée dans un modèle de furet (23). Par conséquent, pour étudier les effets neurologiques à long terme de l’infection par le virus H5N1, nous avons infecté des furets avec des virus H5N1 qui provoquent des symptômes légers chez ces animaux et nous avons observé les effets sur le système nerveux central (SNC) pendant 9 mois. Nous avons également cherché à élucider la voie par laquelle ces virus H5N1 ont envahi le SNC.
Des furets âgés de six mois ont été inoculés par voie intranasale avec 106 PFU de virus A/Hong Kong/483/1997 (H5N1 ; HK483) ou A/Hong Kong/486/1997 (H5N1 ; HK486). Ces virus ont été propagés dans des cellules de rein canin Madin-Darby (MDCK) dans un milieu minimal essentiel complété par 0,3 % d’albumine de sérum bovin. Aux jours 3, 6 et 12 et aux mois 1, 3, 6 et 9 post-infection (p.i.), nous avons prélevé des échantillons de tissus pour l’isolement du virus et l’examen pathologique. Les furets étaient léthargiques et présentaient des signes et des symptômes d’infection respiratoire pendant les 10 premiers jours p.i. mais n’avaient pas de signes neurologiques appréciables, ce qui contraste avec les résultats rapportés précédemment (23). Des échantillons de tissus provenant des cornets nasaux, des poumons, de la trachée, du cerveau, du foie, de la rate, des reins, du cœur, du pancréas et de la moelle épinière ont été prélevés et homogénéisés en une suspension à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate. Le titre du virus dans chaque tissu a été déterminé à l’aide de tests en plaque. Les virus se sont répliqués principalement dans les cornets nasaux, avec des titres viraux atteignant 105 à 106 UFP/gramme de tissu entre 3 et 6 jours p.i. (tableau 1). Les tissus cérébraux prélevés sur des furets infectés par le HK483 ou le HK486 ont été conservés dans du formol tamponné neutre à 10 % et traités pour être inclus en paraffine. Les tissus inclus en paraffine ont été coupés en tranches de 5 mm d’épaisseur et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). Des sections supplémentaires ont été coupées pour une coloration immunohistologique avec des anticorps polyclonaux de lapin contre un virus de la grippe H5. L’examen histologique a révélé une invasion ou des dommages neuronaux, y compris une inflammation des plexus choroïdes (tableau 2). Les furets infectés par le virus HK486 ont présenté des signes d’inflammation non suppurative (Fig. 1a) et d’expression d’antigènes viraux (Fig. 1b) qui ont persisté pendant 12 jours ; les antigènes viraux n’ont pas été détectés à 1 mois p.i. L’encéphalite non suppurative a duré 3 mois (Fig. 1c), avec des cicatrices gliales résiduelles apparaissant à 6 et 9 mois p.i. dans les zones où les antigènes viraux avaient été détectés dans la phase antérieure (Fig. 1d). En outre, les furets infectés par le virus HK486 présentaient des lésions macroscopiques du système olfactif au 12e jour de la période p.i. (Fig. 1e et f). Ces résultats suggèrent que si les virus H5N1 hautement pathogènes affectent principalement les voies respiratoires de l’hôte (1), ils peuvent également produire des complications neurologiques. Contrairement au virus HK486, qui a envahi le parenchyme cérébral des furets et a provoqué de graves lésions parenchymateuses, la deuxième souche H5N1, HK483, a provoqué une vasculite non suppurative sévère sans lésions parenchymateuses apparentes dans le cerveau des furets à 6 jours de vie. Bien que l’antigène viral n’ait pas pu être détecté dans le système vasculaire, les lésions vasculaires étaient évidentes, caractérisées par un gonflement endothélial (Fig. 2a, pointes de flèche), des cellules apoptotiques dispersées (Fig. 2b, pointes de flèche) et une infiltration intramurale de macrophages (Fig. 2a, flèches) et de leucocytes polymorphonucléaires (Fig. 2b, flèche). Des lésions vasculaires ont été trouvées au niveau du thalamus, à la jonction entre la substance grise et la substance blanche, et au niveau du tronc cérébral. Les spécimens de cerveau examinés à 1 et 6 mois p.i. présentaient des lésions hémorragiques indiquant une hémorragie périvasculaire chronique et répétée (Fig. 2c) dans le thalamus, le cervelet et l’espace sous-arachnoïdien du cerveau antérieur (Fig. 2d). Ces observations sont cohérentes avec les rapports de complications cérébrales hémorragiques induites par le virus de la grippe lors des épidémies annuelles (11). La vascularite cérébrale secondaire à une infection virale est relativement fréquente (17) et est probablement à l’origine de la fragilité de la paroi vasculaire, ce qui entraîne une hémorragie cérébrale. Il semble donc raisonnable de conclure que l’infection par le virus H5N1 chez l’homme peut provoquer une hémorragie cérébrale similaire à celle observée lors d’une infection par d’autres virus neurotropes.
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Récupération du virus dans les tissus de furets infectés par le virus H5N1 HK483 ou HK486
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Prévalence des lésions cérébrales chez les furets à différents moments après l’infection par des virus grippaux H5N1 hautement pathogènesa
Lésions cérébrales chez les furets infectés par le virus HK486. (a) Encéphalite sévère non suppurative dans la zone olfactive au jour 6 post-infection (p.i.). (b) Expression de l’antigène viral dans une lésion cérébrale au jour 12 p.i. Les cellules neuronales et gliales sont colorées avec l’antisérum du virus anti-H5. (Encart) Neurones et cellules gliales non infectés. (c) Encéphalite latente dans le tissu cérébral à 3 mois de vie. (d) Formation d’une cicatrice gliale périvasculaire à 9 mois de vie. (e) Lésion cérébrale macroscopiquement visible dans une partie du système olfactif (lobe piriforme) au 12ème jour de vie. (f) Perte partielle d’un bulbe olfactif (partie supérieure du cerveau ) due à une encéphalite virale à 1 mois p.i. Comparez ces images avec le cerveau d’un témoin apparié pour l’âge (cerveau inférieur).
Lésions cérébrales chez les furets infectés par le virus HK483. (a) Vasculite non suppurative proéminente au jour 6 p.i. Notez le gonflement important d’une cellule endothéliale vasculaire (pointes de flèche) et la migration des macrophages dans la paroi vasculaire (flèches), par rapport à l’aspect normal du parenchyme cérébral environnant. (b) Cellules apoptotiques éparses (pointes de flèche) et leucocytes polymorphonucléaires (flèche) dans la paroi vasculaire au 6e jour avant l’accouchement. (c) Lésions hémorragiques anciennes et récentes dans le thalamus d’un furet ayant subi une autopsie à 6 mois avant l’accouchement (pointes de flèche, macrophages chargés d’hémosidérine dans une lésion ancienne ; flèches, hémorragie récente avec globules rouges). (d) Hémorragie sous-arachnoïdienne fraîche dans un cerveau de furet à 6 mois p.i. Notez l’accumulation de globules rouges entre les leptoméninges (ligne noire en pointillés) et la matière arachnoïde (ligne rouge en pointillés).
Pour examiner la voie par laquelle les virus H5N1 envahissent le cerveau des furets, nous avons analysé la distribution des lésions cérébrales et l’expression des antigènes viraux observés chez les furets infectés par les virus HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) et A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Les virus HK213, VN1204 et NCVD18 ont été propagés dans des cellules MDCK dans un milieu minimal essentiel complété par 0,3 % d’albumine de sérum bovin. Des furets de six mois ont été inoculés par voie intranasale avec 106 PFU de virus. Les tissus cérébraux ont été prélevés en phase aiguë, à 3 et 6 jours après l’infection pour VN1204 et NCVD18, et en plus à 12 jours après l’infection pour HK213. Les tissus ont été traités par coloration H&E et immunohistochimie pour un examen histologique. Les lésions du parenchyme cérébral produites par VN1204, NCVD18 et HK213 étaient caractérisées par une encéphalite non suppurative, et le schéma d’expression des antigènes viraux était essentiellement le même que celui de HK486 (données non présentées). Pour comprendre la distribution tridimensionnelle (3D) des lésions cérébrales et des antigènes viraux, nous les avons représentés par imagerie 3D (TRI/3D-SRF2 ; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japon) d’un cerveau de mangouste jaune (Cynictis penicillata), dont l’architecture ressemble beaucoup à celle du cerveau du furet (20). Pour visualiser la voie olfactive (c’est-à-dire la voie sensorielle de l’odorat), nous avons marqué les voies nerveuses du bulbe olfactif au cortex piriforme sur les images 3D comme cadre de référence (Fig. 3a, jaune ; voir également le film S1 dans le matériel supplémentaire). Nous avons trouvé trois modèles distincts de lésions cérébrales, avec et sans antigènes viraux, causées par les différents virus de la grippe H5N1 : celles distribuées uniquement le long de la voie olfactive (Fig. 3b et c, ligne jaune pointillée ; voir également les films S2 et S3) (HK213 et NCVD18) ; celles détectées le long de la voie olfactive (Fig. 3d et e, ligne jaune pointillée ; voir également les films S4 et S5) et dans le tronc cérébral (Fig. 3d et e, flèches blanches ; voir également les films S4 et S5) (HK486 et VN1204) ; et ceux dans d’autres zones (Fig. 3f ; voir également le film S6) (HK483). La base de la séparation du troisième groupe de lésions des deux autres groupes est plus apparente lorsque les distributions des lésions sont examinées depuis la partie postérieure (Fig. 3g et h, jaune versus bleu versus rouge). Ces résultats de cartographie indiquent que la plupart des souches H5N1 que nous avons testées ont envahi le cerveau par la voie olfactive (Fig. 3, ligne jaune pointillée). Une exception a été la souche HK483 (Fig. 3f), qui a clairement ciblé la vascularisation du cerveau chez les furets, produisant des lésions en dehors du système olfactif.
Distribution des lésions cérébrales après infection par la souche HK483, HK486, HK213, NCVD18 ou VN1204 du virus H5N1. Les lésions cérébrales sont cartographiées sur les images tridimensionnelles du cerveau d’une mangouste jaune. Des parties sélectionnées des sections du cerveau ont été analysées ; par conséquent, les tracés des emplacements des lésions sont discontinus. (a) Voie olfactive (jaune). La distribution des lésions et des antigènes viraux (rouge) associés à l’infection par HK213 (b) ou NCVD18 (c) suit la voie olfactive (ligne jaune pointillée). Chez les animaux infectés par la souche HK486 (d) ou VN1204 (e), les lésions et les antigènes viraux sont localisés dans le tronc cérébral (flèches blanches) et la voie olfactive (tracés rouges dans la ligne jaune pointillée). La souche HK483 (f) a provoqué de graves lésions des vaisseaux sanguins, avec des lésions hémorragiques apparentes (tracés bleus). (g) Vue postérieure de la voie olfactive (tracés jaunes). (h) Vue postérieure des lésions hémorragiques (bleu) et de la vasculite (rouge) induites par la souche HK483 en dehors de la voie olfactive. Les panneaux a à f sont des vues ventrales.
Avant que les virus H5N1 puissent devenir pandémiques, ils devront probablement acquérir la capacité de bien se développer dans la partie supérieure des voies respiratoires humaines, ce qui conduirait à une transmission interhumaine efficace par les éternuements et la toux (13, 22). Nos données sur les furets suggèrent que si les virus H5N1 hautement pathogènes prennent pied chez l’homme, ils pourraient provoquer des complications neurologiques subcliniques en envahissant le cerveau par les voies nerveuses ou en provoquant une vascularite cérébrale. Auparavant, un virus H3N2 a été détecté dans des cerveaux de furets ; toutefois, la quantité de virus dans les cerveaux était faible (moins de 102,2 log10 doses infectieuses de 50% d’œufs) et aucune preuve de la présence d’antigènes du virus dans le cerveau n’a été signalée (23). Nous avons constaté que le virus H1N1 pandémique de 2009 se répliquait plus efficacement dans les voies respiratoires des furets que le virus H1N1 saisonnier humain (9, 13, 15) et qu’il provoquait des lésions non suppuratives du bulbe olfactif ; toutefois, nous n’avons pas trouvé de virus dans le parenchyme cérébral de ces animaux (données non présentées). Par conséquent, l’invasion du parenchyme cérébral, comme le démontre la présence d’antigènes viraux, est une caractéristique des virus H5N1. Il serait donc pertinent de réaliser des études rétrospectives et prospectives pour détecter les complications neurologiques subcliniques chez les patients infectés par le virus H5N1. Nos résultats font craindre que des complications neurologiques subcliniques puissent accompagner les infections respiratoires graves lors de la propagation mondiale des virus H5N1.