Abstract
Des études antérieures ont démontré que l’apport en choline est directement lié à l’obésité et à la résistance à l’insuline induites par un régime riche en graisses chez les souris. L’objectif de cette étude était d’évaluer si l’apport en choline pouvait également moduler l’obésité et la résistance à l’insuline causées par un défaut génétique. Des souris ob/ob mâles de huit semaines ont été nourries pendant deux mois avec un régime pauvre en choline ou complété par de la choline. Le poids des tissus, y compris la masse grasse et la masse maigre, a été évalué. La signalisation intracellulaire, le glucagon et l’insuline plasmatiques, ainsi que les tests de tolérance au glucose et à l’insuline ont également été étudiés. Le régime déficient en choline a ralenti la prise de poids corporel et diminué la masse grasse. La carence en choline a également diminué le taux de glucose plasmatique et amélioré la tolérance au glucose et à l’insuline, bien que la stéatose hépatique ait été exacerbée. Une activité lipolytique adipeuse accrue, une diminution du glucagon plasmatique et une expression réduite du récepteur hépatique du glucagon ont également été observées avec le régime déficient en choline. Nos résultats démontrent qu’un régime déficient en choline peut diminuer la masse grasse et améliorer la tolérance au glucose chez les souris obèses et diabétiques causées par un défaut génétique.
1. Introduction
La choline est un facteur alimentaire important, qui est impliqué dans certains processus cruciaux tels que la biosynthèse du neurotransmetteur acétylcholine et du composant membranaire majeur phosphatidylcholine (PC) . Le PC peut être synthétisé soit par la voie de la CDP-choline, soit par méthylation de la phosphatidyléthanolamine par la phosphatidyléthanolamine N-méthyltransférase (PEMT). La voie de la PEMT n’est quantitativement significative que dans le foie. La choline est également un précurseur essentiel du neurotransmetteur acétylcholine, qui agit par l’intermédiaire des récepteurs muscariniques et nicotiniques de l’acétylcholine. Ces dernières années, un lien possible entre la choline et l’obésité/le diabète est apparu. Le potentiel des récepteurs muscariniques de l’acétylcholine comme cible thérapeutique de l’obésité a été proposé. Récemment, nous avons découvert que la déficience en PEMT pouvait protéger les souris contre l’obésité et l’insulinorésistance induites par un régime riche en graisses. Cependant, cette protection disparaissait lorsqu’une dose élevée de choline était ajoutée au régime riche en graisses. La voie PEMT, suivie du catabolisme du PC, est la seule voie de biosynthèse de la choline connue chez les mammifères. Une diminution significative de la teneur en choline dans plusieurs tissus a été constatée chez les souris déficientes en PEMT (Li et al., données non publiées), ce qui établit un lien direct entre la choline et l’obésité/résistance à l’insuline induite par un régime riche en graisses. Dans la présente étude, nous avons nourri des souris ob/ob avec un régime déficient en choline (CD) pour évaluer si la carence en choline pourrait également moduler l’obésité et la résistance à l’insuline d’origine génétique.
2. Matériel et méthodes
2.1. Animaux et régime alimentaire
Toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de protection des animaux de l’Université d’Alberta, conformément aux directives du Conseil canadien de protection des animaux. Des souris ob/ob mâles de 8 semaines provenant du Jackson Laboratory ont été acclimatées pendant une semaine. Cinq souris ont été utilisées dans chaque groupe. Les souris ont eu libre accès à des régimes carencés en choline (CD) ou supplémentés en choline (CS) pendant 2 mois. Le régime CD (MP Biomedicals Canada, n° de catalogue 901387) contenait 20 % de graisse sous forme de saindoux. Le régime CS consistait en un régime CD auquel était ajouté 0,4 % (p/p) de chlorure de choline. Les souris ont été sacrifiées par anesthésie à l’isoflurane, suivie d’une ponction cardiaque.
2.2. Gain de poids corporel, mesure de la masse maigre et de la masse grasse
Le poids corporel a été mesuré chaque semaine. La masse maigre et la masse grasse ont été analysées, 2 mois après la mise au régime des souris (prémortem), à l’aide du système EchoMRI.
2.3. Test de tolérance au glucose et à l’insuline
Test de tolérance au glucose : après un jeûne de 12 heures, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale (i.p.) de 0,5 g de dextrose/kg de poids corporel dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérilisée. Test de tolérance à l’insuline : après un jeûne de 6 heures, les souris ont reçu une injection i.p. de 1,0 unité d’insuline (Sigma)/kg de poids corporel dans du PBS. Les concentrations de glucose dans le sang ont été mesurées par un glucomètre dans les saignées de la queue avant et aux moments indiqués après l’injection.
2.4. Mesures de l’activité des complexes I/II mitochondriaux
Les activités des complexes I et II mitochondriaux ont été déterminées en utilisant des protéines mitochondriales. Brièvement, pour isoler la protéine mitochondriale, les échantillons ont été maintenus sur la glace et homogénéisés dans un tampon contenant 75 mM de saccharose, 225 mM de sorbitol, 1 mM d’EGTA et 0,1% d’albumine de sérum bovin sans acide gras dans 10mM de Tris-HCl pH 7,4. L’homogénat a été centrifugé à 600× g pendant 15 min, et le surnageant résultant a été centrifugé à nouveau pendant 20 min à 16 200 rpm. La protéine mitochondriale contenue dans les culots a été mise en suspension dans un tampon contenant 20 mM de Tris et 25 mM de saccharose (pH7,4) et conservée à -80°C jusqu’à son utilisation. La mesure de l’activité a été effectuée dans un spectrophotomètre pendant une période de 5min sous forme d’une diminution de l’absorbance à 600nm due à la réduction du 2,6-dichlorophénol-indophénol (DCPIP) en ubiquinone-1 en présence de NADH (substrat du complexe I) ou de succinate (substrat du complexe II) en conséquence. La réaction a été effectuée en présence d’antimycine et de cyanure de potassium comme inhibiteurs du complexe III et du complexe IV. La roténone, comme inhibiteur du complexe I, a également été impliquée dans le tampon de réaction pour l’activité du complexe II.
2.5. Histologie et immunoblotting
Pour l’histologie, les foies ou les coussinets graisseux ont été disséqués dans du formaldéhyde à 10% dans du PBS, puis suivis par la coloration de routine à l’hématoxyline et à l’éosine. Pour l’immunoblotting, après l’homogénéisation et la centrifugation à 600× g des échantillons de foie, les surnageants résultants ont été soumis à une détermination de la concentration en protéines (BioRad) pour s’assurer qu’une quantité égale de protéines était chargée sur SDS-PAGE. Tous les anticorps primaires contre la lipase sensible aux hormones (phospho-HSL/total HSL), la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK), l’acétyl-CoA carboxylase (phospho-ACC/total ACC) et la protéine kinase activée par l’AMP (phospho-AMPK/total AMPK) ont été achetés chez Cell Signaling. Les anticorps de l’isozyme 4 de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK4), du récepteur du glucagon ont été obtenus auprès d’Abcam, mais le suppresseur de la signalisation des cytokines 3 (SOCS3) et PGC-1α ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology.La tubline ou l’actine ont été utilisées comme contrôles de charge pour la normalisation. L’image a été analysée par le logiciel ImageJ.
2.6. Mesure de l’insuline et du glucagon plasmatiques
Les mesures ont été effectuées à l’aide d’un kit de dosage du glucagon, de l’insuline de souris/rat (Meso Scale Discovery) selon les instructions de la société.
2.7. Analyse statistique
Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les différences ont été évaluées à l’aide du test t de l’étudiant. Une valeur de 𝑃<0,05 a été considérée comme significative.
3. Résultats
Le régime déficient en choline a significativement ralenti le gain de poids corporel jusqu’à 2 mois (Figure 1(a)) sans influencer la consommation alimentaire (consommation alimentaire quotidienne 7,21±1,23 g pour les souris CD contre 7,39±1,31 g pour les souris CS, 𝑃>0,05). Il y avait une différence significative dans le poids corporel initial entre les deux groupes (30,42±1,70 g pour les souris CD contre 26,3±2,26 g pour les souris CS, 𝑃=0,01). La carence en choline n’a pas influencé le poids du cœur, du foie ou des reins (Figure 1(b)), mais on a observé une diminution significative du poids de la graisse épididymaire et périrénale (Figure 1(c)). Une analyse plus poussée, utilisant l’imagerie par résonance magnétique, a montré que la carence en choline diminuait la masse grasse du corps entier et augmentait la masse maigre, qu’elle soit exprimée en masse absolue ou en pourcentage relatif de la masse du corps entier (Figure 1(d)). La carence en choline a augmenté l’expression de la lipase sensible aux phosphohormones du tissu adipeux, une forme activée de l’enzyme (figure 1(e)). En revanche, la carence en choline n’a pas modifié la morphologie du tissu adipeux (figure 1(f)).
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Choline-atténue la prise de poids corporel et augmente la capacité lipolytique adipeuse. Des souris ob/ob mâles de 8 semaines ont eu un accès libre à des régimes CD ou CS pendant 2 mois. La prise de poids corporel (a), le poids des tissus (b), le poids de la graisse épididymaire et périlésionnelle (c), ainsi que la masse grasse et la masse maigre (d) ont été mesurés. L’expression protéique de la lipase phospho- et totale sensible aux hormones dans le tissu adipeux a été évaluée par immunoblotting (e). Les coupes du coussinet adipeux ont été colorées avec H & E (f). ∗∗∗𝑃<0,01 et ∗𝑃<0,05 par rapport au groupe CS.
En plus d’influencer le poids corporel, la carence en choline a également diminué le glucose plasmatique à jeun (14,3±1,67 contre 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) et le niveau de glucagon (Figure 2(a)), bien qu’elle n’ait eu aucun effet sur le niveau d’insuline plasmatique (Figure 2(b)). Une intolérance au glucose et à l’insuline significativement améliorée a été observée chez les souris soumises à un régime déficient en choline (Figures 2(c)-2(d)). Pour étudier le mécanisme sous-jacent, les enzymes clés de l’oxydation du glucose ont été analysées. La carence en choline a réduit l’expression protéique hépatique de PDK4 (Figure 3(a)), un régulateur négatif de l’activité de la pyruvate déshydrogénase qui contrôle l’afflux d’acétyl-CoA mitochondrial, ce qui indique une utilisation accrue du glucose. De même, la PGC-1α hépatique (un modulateur en amont bien connu de PDK4) et la PEPCK (une cible en aval de la PGC-1 α et une enzyme clé de la gluconéogenèse) étaient réduites (Figure 3(b)), ce qui suggère une diminution de la gluconéogenèse. De plus, nous avons cherché à savoir si l’amélioration de l’intolérance au glucose et à l’insuline pouvait être associée à l’altération de l’inflammation hépatique et de la fonction mitochondriale. Ni l’expression protéique de SOCS3 (Figure 3(c)), un marqueur de pro-inflammation, ni l’activité de la citrate synthase mitochondriale n’ont été affectées (données non présentées). Cependant, l’activité du complexe II mitochondrial, mais pas celle du complexe I, a été significativement réduite par la carence en choline (Figure 3(d)). Il est intéressant de noter que l’expression protéique du récepteur hépatique du glucagon était également diminuée par la carence en choline (figure 3(e)).
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Choline-améliore l’intolérance au glucose et à l’insuline. Des souris ob/ob mâles de 8 semaines ont eu un accès libre à des régimes CD ou CS pendant 2 mois. Le niveau de glucagon (a) et d’insuline (b) du plasma à jeun a été mesuré. Un test de tolérance au glucose intrapéritonéal (c) et un test de tolérance à l’insuline (d) ont été réalisés. ∗∗∗𝑃<0,01 et ∗𝑃<0,05 par rapport au groupe CS.
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Mécanismes moléculaires impliqués dans l’amélioration de la sensibilité à l’insuline chez les souris ob/ob soumises à un régime déficient en choline.régime déficient en choline. Des souris ob/ob mâles âgées de 8 semaines ont eu un accès libre à des régimes CD ou CS pendant 2 mois. L’expression protéique hépatique de PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) et du récepteur du glucagon (e) a été évaluée par immunoblotting. Les activités des complexes I et II mitochondriaux ont également été mesurées (d). ∗𝑃<0,05 par rapport au groupe CS.
Bien qu’elle améliore la tolérance au glucose, la carence en choline exacerbe la stéatose hépatique, soutenue par l’analyse histologique et l’augmentation de la masse de triglycérides hépatiques (Figure 4(a)). Pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la stéatose hépatique induite par la carence en choline, nous nous sommes intéressés aux enzymes impliquées dans la β-oxydation des acides gras et la lipogenèse. La carence en choline a augmenté l’activité de la glycérol-3-phospho-acyltransférase (GPAT) hépatique (Figure 4(b)) et a diminué l’activité de la β-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase (β-HAD) (Figure 4(c)), une enzyme clé de la β-oxydation des acides gras, ce qui indique que davantage d’acides gras intracellulaires ont été canalisés vers la biosynthèse des lipides plutôt que vers l’oxydation. Cette notion a été renforcée par une diminution de l’expression de phospho-AMPK et de phospho-ACC hépatiques (figure 4(d)), qui active alors l’ACC et renforce la lipogenèse hépatique.
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Mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de la stéatose hépatique chez les souris ob/ob soumises à un régime déficient en choline.régime déficient en choline. Des souris ob/ob mâles âgées de 8 semaines ont eu un accès libre à des régimes CD ou CS pendant 2 mois. Les sections de foie ont été colorées avec le protocole de coloration H & E, et la quantité de triglycérides hépatiques a été mesurée (a). Les activités de la glycérol-3-phosphate-acyltransférase (GPAT) (b) et de la β-hydroxyl acyl-CoA déshydrogénase (β-HAD) (c) ont été dosées. L’expression protéique de la phospho-AMPK et de la phospho-ACC a été suivie (d). ∗𝑃<0,05 par rapport au groupe CS.
4. Discussion
Dans des travaux précédents, nous avons démontré que la supplémentation en choline est liée à l’obésité et à la résistance à l’insuline induites par un régime riche en graisses chez les souris déficientes en PEMT . Récemment, nous avons découvert que la résistance à l’insuline induite par la choline est spécifique à la choline, non seulement chez les souris de type sauvage mais aussi chez les souris déficientes en PEMT (Wu et Vance et al. données non publiées). Dans la présente étude, nous avons examiné l’impact de la privation de choline sur les souris ob/ob. Nous avons démontré cinq nouveaux effets de la carence en choline : (1) augmentation de l’activité lipolytique adipeuse ; (2) amélioration de l’oxydation du glucose ; (3) diminution de l’oxydation des acides gras hépatiques ; (4) expression régulée à la baisse du récepteur hépatique du glucagon ; (5) réduction de l’activité du complexe II mitochondrial hépatique.
4.1. La carence en choline atténue la prise de poids corporel
La carence en choline atténue significativement l’obésité induite par un régime riche en graisses chez les souris Pemt-/- et la prise de poids chez les souris ob/ob. Cependant, Raubenheimer et al. ont rapporté que la carence en choline n’affectait pas la prise de poids ou le poids du tissu adipeux . La différence entre les deux études pourrait être due à des différences dans les modèles animaux et les protocoles d’alimentation. Dans l’étude de Raubenheimer, les souris C57Bl/6 ont reçu un régime riche en graisses ou pauvre en graisses pendant 8 semaines, mais les souris n’ont reçu le régime CD ou CS que pendant les 4 dernières semaines. Nos souris ob/ob ont reçu un régime CD ou CS riche en graisses pendant 8 semaines. Dans la littérature, les souris ob/ob mâles et femelles ont été largement utilisées dans des études métaboliques, telles que la prise de poids corporel et la sensibilité à l’insuline hépatique (et musculaire), et aucun effet significatif du sexe n’a été signalé. Dans notre étude, seules des souris ob/ob mâles ont été utilisées.
Notre étude actuelle démontre que la choline peut également moduler l’obésité d’origine génétique. Puisque la carence en choline n’a pas influencé la consommation alimentaire, l’augmentation de l’activité lipolytique adipeuse (expression accrue de la lipase hormono-sensible active) peut expliquer la réduction de la masse grasse et le gain de poids corporel. En outre, nous ne pouvons pas exclure les possibilités que la carence en choline puisse améliorer la dépense énergétique ou l’expression de l’UCP1 dans le tissu adipeux brun et de l’UCP2/UCP3 dans les muscles squelettiques, qui sont des facteurs potentiels contribuant à la diminution de la prise de poids corporel.
4.2. La carence en choline améliore la tolérance au glucose
Contrairement à la supplémentation en choline, qui est liée à la résistance à l’insuline induite par un régime riche en graisses chez les souris , la carence en choline améliore la tolérance au glucose chez les souris ob/ob. Ceci est cohérent avec l’étude de Raubenheimer, dans laquelle des souris C57Bl/6 soumises à un régime riche en graisses CD présentaient des niveaux d’insuline réduits et une meilleure tolérance au glucose par rapport à un régime riche en graisses supplémenté en choline. Un taux élevé de glucagon plasmatique est généralement constaté chez les patients diabétiques de type 2. L’injection de choline a augmenté les taux plasmatiques d’insuline et de glucagon chez les rats. À l’inverse, la carence en choline dans notre étude a diminué le glucagon plasmatique et l’expression du récepteur du glucagon. Comme ces dernières années, les antagonistes du récepteur du glucagon ont été proposés comme médicaments thérapeutiques potentiels pour le diabète de type 2, la diminution de l’expression protéique du récepteur du glucagon chez les souris ob/ob soumises à un régime carencé en choline peut, dans une certaine mesure, expliquer l’amélioration de la tolérance au glucose. La diminution de l’expression de la PGC-1α hépatique était concomitante avec une régulation négative de la PEPCK et de la PDK4, indiquant une diminution de la production de glucose et une augmentation de l’oxydation du glucose. La régulation à la baisse de l’activité β-HADH a suggéré une diminution de l’oxydation des acides gras. Ces processus se sont accompagnés d’une diminution de l’activité du complexe II mitochondrial, ce qui pourrait refléter une réponse compensatoire à la réduction du stress oxydatif mitochondrial. Ainsi, la tolérance au glucose améliorée par la CD était due à une diminution de la production hépatique de glucose et à une augmentation de l’utilisation du glucose. Cela pourrait se produire par la suppression du récepteur hépatique du glucagon, qui régule l’AMPK via l’adénylate cyclase, modulant ainsi la PGC-1α et ses cibles en aval, telles que la PEPCK et la PDK4, ainsi que la capacité de transport d’électrons de la mitochondrie hépatique. Ainsi, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour prouver si le récepteur du glucagon pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour le diabète.
4.3. La déconnexion entre le foie gras et la résistance à l’insuline
Le foie gras a été montré comme un prédicteur indépendant de l’obésité du diabète de type 2. On pense que l’augmentation des acides gras intracellulaires joue un rôle causal dans la résistance à l’insuline hépatique . Dans la présente étude, la carence en choline a exacerbé la stéatose hépatique, dans laquelle une diminution de l’activité de la β-hydroxyacyl CoA déshydrogénase et une augmentation de l’activité de la glycérol palmitoyl-acyl transférase ont été observées, ce qui suggère un rôle de la choline dans la modulation du métabolisme des acides gras. Par conséquent, la réorientation des acides gras vers le stockage des triglycérides hépatiques peut être un mécanisme de protection initial pour réduire les concentrations intracellulaires d’acides gras hépatiques. La carence en choline à long terme est cependant liée à l’hépatostéatose, au risque d’anomalie du tube neural, ainsi qu’au risque de cancer et de perte de mémoire, ce qui peut limiter l’utilisation d’un régime carencé en choline comme stratégie thérapeutique à long terme pour l’obésité et la résistance à l’insuline.
En conclusion, la carence en choline peut prévenir la prise de poids corporel et améliorer la tolérance au glucose chez les souris ob/ob. Une restriction modeste de la consommation d’aliments à forte teneur en choline peut être bénéfique pour les patients obèses, prédiabétiques et diabétiques. Nos résultats suggèrent de nouvelles approches thérapeutiques possibles.
Abréviations
| PC: | Phosphatidylcholine |
| PEMT: | Phosphatidyléthanolamine N-méthyltransférase |
| CD : | Choline deficient |
| CS: | Choline supplement |
| HSL: | Hormone sensitive lipase |
| PEPCK : | Phosphoenolpyruvate carboxykinase |
| ACC: | Acetyl-CoA Carboxylase |
| AMPK: | Protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) |
| PDK4 : | Pyruvate déshydrogénase kinase isozyme 4 |
| SOCS3: | Suppresseur de la signalisation des cytokines 3 |
| GPAT: | Glycérol-3-phospho-acyltransférase. |
Contribution des auteurs
G. Wu et L. Zhang ont contribué à parts égales.
Divulgation des auteurs
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention (MOP 89793) des Instituts de recherche en santé du Canada.