Aucune régulation à la hausse de CAP1, mais une phosphorylation S308/S310 élevée, a été détectée dans les cellules cancéreuses du pancréas
Les niveaux de protéine CAP1 ont été déterminés par Western blotting dans un panel de lignées cellulaires cancéreuses du pancréas couramment utilisées {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 et Mia PaCa-229}, et comparés à ceux de la lignée cellulaire immortalisée mais non transformée du pancréas hTERT-HPNE30, qui sert de contrôle. Comme le montre la figure 1A, les quatre lignées cellulaires cancéreuses expriment des niveaux abondants de CAP1, comparables à ceux des cellules HeLa, dont nous avions précédemment signalé qu’elles exprimaient des niveaux abondants de CAP1 et de CAP212. Nous avons constaté que les cellules hTERT-HPNE non transformées exprimaient des niveaux comparables de CAP1 à ceux des lignées cellulaires cancéreuses. Nous avons également examiné les niveaux d’expression de l’autre isoforme CAP, CAP2, et avons constaté que les cellules PANC-1 et Mia PaCa-2 avaient une expression de CAP2 considérablement régulée par rapport à celle des cellules hTERT-HPNE (Fig. 1A).
Une phosphorylation S308/S310 élevée sur CAP1, mais pas une expression de CAP1 régulée à la hausse, a été détectée dans les cellules cancéreuses pancréatiques. (A) Le Western blot révèle que des niveaux d’expression abondants de CAP1 comparables à ceux des cellules HeLa ont été détectés dans les quatre lignées cellulaires cancéreuses, et les cellules pancréatiques témoins (hTERT-HPNE) ont un niveau d’expression de CAP1 similaire. Les résultats du blot CAP2 montrent que les cellules cancéreuses PANC-1 et Mia PaCa-2 expriment des niveaux abondants de CAP2 qui étaient remarquablement plus élevés que ceux des cellules témoins hTERT-HPNE. (B) Le Western blot révèle une phosphorylation élevée de S308/S310 sur CAP1 dans les cellules cancéreuses pancréatiques PANC-1 et CFPAC-1 par rapport à celle des cellules pancréatiques hTERT-HPNE non transformées. L’anticorps spécifique au phosphore reconnaît les signaux phosphorés sur les deux résidus. Les séquences alignées en haut montrent les séquences qui entourent le site phosphorégulateur en tandem. Les résidus de sérine (S307 & S309 sur CAP1 de souris ; S308 & S310 sur CAP1 humain) dans le site en tandem sont mis en évidence en gras et en italique (également soulignés). Les signaux phosphorescents ont été quantifiés par densitométrie, et les résultats de trois expériences ont été analysés par le test t de Student et reportés dans le graphique où les barres d’erreur représentent les S.E.M. « * » indique P < 0,05 et « ** » indique P < 0,01. (C) Le traitement des cellules avec l’inhibiteur de GSK3 6-BIO pendant 16 heures a remarquablement réduit la phosphorylation de CAP1 à la fois dans les cellules PANC-1 du cancer du pancréas et dans les cellules hTERT-HPNE, de manière dose-dépendante. Le 6-BIO a également réduit de façon similaire la phosphorylation de CAP1 dans les cellules CFPAC-1 (non montré). La GAPDH sert de contrôle de charge dans le Western blotting.
Nous avons précédemment rapporté que GSK3 phosphoryle S309 sur le CAP124 de la souris (équivalent à S310 sur le CAP1 humain ; séquences alignées présentées dans la figure 1B). Compte tenu de l’hyperactivation signalée de GSK3 dans le cancer du pancréas25, nous avons étudié l’élévation potentielle de la phosphorylation S308/S310 sur CAP1 dans les cellules cancéreuses, en utilisant un anticorps spécifique de phosphore qui reconnaît les signaux de phosphore sur les deux résidus de sérine en Western blotting24. Il est intéressant de noter que la phosphorylation S308/310 était significativement plus élevée dans les cellules cancéreuses que dans les cellules témoins (Fig. 1B, données quantifiées pour les lignées cellulaires PANC-1 et CFPAC-1 uniquement, mais des résultats similaires ont été obtenus avec les cellules AsPC-1 et Mia PaCa-2). Ensuite, nous avons inhibé GSK3 en traitant les cellules cancéreuses avec un puissant inhibiteur de GSK3, le 6-BIO (6-bromoindirubin-3′-oxime)31 et nous avons constaté que le traitement réduisait la phosphorylation S308/S310 sur CAP1 dans les cellules PANC-1 et CFPAC-1, de manière dose-dépendante (Fig. 1C, montré pour les cellules PANC-1 uniquement). Le traitement avec 6-BIO a également réduit la phosphorylation de CAP1 dans les cellules de pancréas de contrôle. De manière cohérente, un inhibiteur plus sélectif de GSK3, LiCl32, a également réduit la phosphorylation de CAP1 dans les cellules PANC-1 et AsPC-1, comme indiqué plus loin. Ces résultats confirment que GSK3 fait également partie du mécanisme de phosphorylation de CAP1 à S308/S310 dans les cellules cancéreuses du pancréas. Il est également à noter que le traitement des cellules cancéreuses et des cellules de contrôle avec 6-BIO a constamment conduit à une régulation à la hausse notable de CAP1, par un mécanisme inconnu.
Le knockdown de CAP1 a conduit à une augmentation des fibres de stress ainsi qu’à une réduction de la motilité et de l’invasion des cellules cancéreuses
Nous avons ensuite tenté de réduire CAP1 au silence pour déterminer les rôles de CAP1 dans les cellules cancéreuses du pancréas. Le paradigme de knockdown stable que nous avons développé précédemment est compatible avec une stratégie de sauvetage, qui permet de vérifier la spécificité des phénotypes dérivés de la déplétion de CAP112,18,24. À l’aide de deux constructions shRNA S2 et S3 qui ciblent des séquences nucléotidiques indépendantes et réduisent efficacement CAP1 au silence dans les cellules de HeLa et de cancer du sein12,18,24,33, nous avons pu générer des clones stables avec un knockdown efficace de CAP1 dans les cellules PANC-1 et AsPC-1, comme le confirme le Western blotting (Fig. 2A). Deux clones stables de knockdown, chacun dérivé de PANC-1 (S2-1 et S3-3) et AsPC-1 (S2-3 et S2-7), ont été établis respectivement par sélection à la néomycine. Les tentatives de réduire CAP1 au silence dans les lignées cellulaires cancéreuses CFPAC-1 et Mia PaCa-2 ont toutefois échoué. Les cellules CFPAC-1 n’ont pas réussi à former des colonies après une sélection antibiotique, tandis qu’aucune des quelque deux douzaines de colonies stables criblées ne présentait une réduction substantielle de l’expression de CAP1 dans les cellules Mia PaCa-2 (données non présentées).
Le knockdown de CAP1 dans les cellules cancéreuses a entraîné une augmentation des fibres de stress de l’actine et une réduction de la motilité et de l’invasion cellulaires. (A) Le knockdown efficace de CAP1 dans deux clones stables pour les cellules PANC-1 et AsPC-1 a été confirmé par Western blotting. CAP1 a été détecté dans le Western blotting, où la GAPDH a été utilisée comme contrôle de charge. (B) La déplétion de CAP1 dans les cellules PANC-1 a entraîné une augmentation des fibres de stress d’actine. Dans les cellules témoins qui hébergent le vecteur vide pour le shRNA (Vec), il y avait très peu de fibres de stress d’actine (indiquées par des flèches). En revanche, dans les cellules dont CAP1 a été éliminé (S2-1 et S3-3), les fibres de stress de l’actine ont été renforcées (indiquées par des flèches), comme observé en microscopie à fluorescence après coloration à la phalloïdine. (C) La déplétion de CAP1 a réduit la motilité des cellules PANC-1 et AsPC-1, comme le montrent les essais de cicatrisation et de migration Transwell (pour les PANC-1 uniquement). Pour les tests de migration Transwell, ~2 × 104 cellules privées de sérum pendant une nuit ont été chargées sur chaque insert placé dans un puits rempli de milieu contenant du sérum. Après 16 heures, les cellules migrantes ont été notées et les données de trois expériences indépendantes ont été recueillies, analysées à l’aide du test t de Student et représentées dans le graphique où les barres d’erreur représentent les S.E.M. « * » indique P < 0,05 par rapport à celles des cellules témoins hébergeant un vecteur vide (Vec). (D) La déplétion de CAP1 réduit l’invasion du Matrigel dans les cellules PANC-1. Les essais et la collecte et l’analyse des données ont été menés de manière similaire à ceux des essais de migration Transwell, sauf que les membranes d’insertion ont été pré-revêtues de Matrigel. « * » indique P < 0,05 par rapport à celui des cellules témoins. (E) Réduction de l’EMT dans les cellules PANC-1 knockdown CAP1, comme l’indique l’augmentation de l’expression de la E-Cadhérine ainsi que la réduction des niveaux d’expression de la Vimentine dans les clones stables CAP1-knockdown. La GAPDH sert de contrôle de charge dans les Western blots.
Nous avons d’abord examiné les altérations morphologiques et du cytosquelette d’actine dans les cellules PANC-1 et AsPC-1 knockdown CAP1. Contrairement à l’augmentation de la taille des cellules de HeLa et des cellules de cancer du sein métastatique dont CAP1 a été supprimé12,18,24, la suppression de CAP1 n’a pas entraîné d’augmentation notable de la taille des cellules PANC-1 ou AsPC-1. Nous avons ensuite coloré le cytosquelette d’actine dans les cellules PANC-1 avec de la phalloïdine, suivi d’une microscopie à fluorescence. Les cellules PANC-1 (et les cellules cancéreuses du pancréas en général) semblent avoir des structures de cytosquelette d’actine mal organisées, surtout en termes de fibres de stress (Fig. 2B), par rapport aux lignées cellulaires couramment utilisées pour les études du cytosquelette d’actine, comme les fibroblastes HeLa et NIH3T312,24. Néanmoins, des fibres de stress plus importantes ont été mises en évidence dans les cellules PANC-1 dont le CAP1-knockdown a été éliminé, par rapport aux cellules témoins (Fig. 2B). Les 26 cellules témoins qui hébergent un vecteur vide examiné ont toutes montré une présence très limitée de fibres de stress. En revanche, 20 des 27 (74,1%) cellules S2-1 et 18 des 23 (78,3%) cellules S3-3 CAP1-knockdown examinées présentaient des fibres de stress remarquablement développées, comme le montre la Fig. 2B. L’accumulation de fibres de stress a été observée de manière constante dans d’autres cellules avec une déplétion de CAP112,13, un phénotype qui est censé avoir dérivé de la perte des deux fonctions de CAP1 dans la séquestration des monomères d’actine et dans la promotion du renouvellement des filaments d’actine.
Concordant avec l’augmentation des fibres de stress, la déplétion de CAP1 a été signalée pour réduire la motilité dans un certain nombre de types de cellules de mammifères, y compris les cellules cancéreuses13,14,17,18,19. On a également constaté que l’élimination transitoire de CAP1 dans les cellules cancéreuses du pancréas réduisait la motilité des cellules dans les essais de cicatrisation14. Nous avons testé l’effet du knockdown stable de CAP1 sur l’invasivité des cellules cancéreuses du pancréas, en effectuant des tests de cicatrisation, des tests de migration Transwell ainsi que des tests d’invasion Matrigel. La déplétion de CAP1 a considérablement réduit la motilité cellulaire dans les essais de cicatrisation pour les cellules PANC-1 et AsPC-1 (Fig. 2C), ce qui est cohérent avec les résultats précédemment rapportés14. Les plaies dans les cellules PANC-1 knockdown CAP1 (à la fois S3-3 et S2-1) n’ont guéri que marginalement 24 heures après l’introduction, alors que dans les cellules témoins, la brèche avait presque complètement été comblée. Des effets similaires ont été observés dans les clones stables d’AsPC-1 CAP1-knockdown S2-3 et S2-7 (Fig. 2C). Les résultats des essais de migration Transwell des cellules PANC-1 étaient cohérents avec ceux des essais de cicatrisation, comme le montre le graphique des résultats quantifiés dans le panneau inférieur (Fig. 2C). De plus, les essais d’invasion révèlent que la déplétion de CAP1 a également réduit la capacité des cellules cancéreuses PANC-1 à pénétrer et à envahir le Matrigel (Fig. 2D). Les analyses par test t de Student des données recueillies lors de trois essais indépendants révèlent une réduction significative de l’invasion dans les cellules stables PANC-1 privées de CAP1 (Fig. 2D). Enfin, puisque l’EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) est liée à l’invasivité des cellules cancéreuses, nous avons testé l’effet potentiel du knockdown de CAP1 sur l’EMT. En effet, les cellules PANC-1 dont CAP1 a été éliminé présentaient une régulation positive de l’E-Cadherin, ce qui indique une réduction de l’EMT (Fig. 2E). Nous avons également testé un autre marqueur d’EMT, la Vimentine, et avons constaté que la déplétion de CAP1 réduisait son expression (Fig. 2E). Ensemble, ces résultats soutiennent un rôle requis pour CAP1 dans l’invasivité et l’EMT dans les cellules cancéreuses PANC-1.
L’inhibition de GSK3, qui supprime la phosphorylation de CAP1, réduit la motilité et l’invasion des cellules cancéreuses
Nos résultats précédents suggèrent que la phosphorylation transitoire est cruciale pour la fonction de CAP1 dans la régulation du cytosquelette d’actine24. La phosphorylation élevée de CAP1 dans les cellules cancéreuses du pancréas, cohérente avec l’activation de GSK3, suggère que la phosphorégulation peut également jouer un rôle pour la fonction de CAP1 dans l’invasivité des cellules cancéreuses. Nous avons testé cette possibilité en inhibant GSK3, qui supprime la phosphorylation de S308/S310 et perturbe entre-temps la régulation de CAP1 par une phosphorylation transitoire au niveau du site de régulation. Les cellules PANC-1 ont été traitées avec du 6-BIO, suivi par des tests de migration et d’invasion cellulaire. Les effets de la réduction de la phosphorylation S308/S310 sur CAP1, par traitement avec 5 μM de 6-BIO (Fig. 1C), ont été testés en premier. Comme le montre la figure 3A, le traitement au 6-BIO a réduit de manière significative la motilité des cellules PANC-1 dans les essais de cicatrisation et de migration Transwell. Nous avons également confirmé que le traitement des cellules PANC-1 et AsPC-1 avec un autre inhibiteur de GSK3, LiCl, a réduit la phosphorylation de CAP1 ainsi que la motilité des cellules dans les tests de cicatrisation (Fig. 3A,B). De plus, le traitement au 6-BIO a également réduit l’invasion des cellules PANC-1 par le Matrigel (Fig. 3C). Enfin, comme GSK3 est connu pour réguler un large éventail de fonctions cellulaires par le biais d’une pléthore de molécules substrats, l’effet de l’inhibition de GSK3 sur la motilité cellulaire est susceptible d’être un résultat collectif par le biais de multiples cibles de GSK3 qui sont impliquées dans la régulation du cytosquelette, de la polarisation cellulaire et de la migration34,35. Nous avons donc testé et comparé les effets du 6-BIO sur la réduction de la motilité cellulaire dans les cellules PANC-1 dépourvues de CAP1 et dans les cellules témoins. Comme le montre le graphique de la figure 3D, le traitement au 6-BIO a réduit de manière significative la motilité des cellules témoins (Vec) mais pas celle des cellules CAP1-knockdown (S2-1 et S3-3) dans les essais de cicatrisation. Pris ensemble, ces résultats soutiennent que la phosphorégulation par S308/S310 joue un rôle important pour que CAP1 favorise la motilité et l’invasion dans les cellules cancéreuses pancréatiques.
L’inhibition de GSK3, qui a réduit la phosphorylation de CAP1, a également compromis la motilité et l’invasion des cellules cancéreuses. (A) Le traitement des cellules PANC-1 avec du 6-BIO ou du LiCl a réduit la motilité des cellules dans les essais de cicatrisation et de migration Transwell. Le traitement avec 100 mM LiCl a également réduit efficacement la phosphorylation de CAP1 dans les cellules PANC-1. Les essais de migration Transwell avec des cellules PANC-1 ont été réalisés de manière similaire à celle décrite dans la Fig. 2, où NT indique les cellules sans traitement au 6-BIO. (B) Le traitement avec 100 mM LiCl a également réduit de façon notable la phosphorylation de CAP1 dans les cellules AsPC-1, ainsi que la motilité cellulaire dans les essais de cicatrisation. (C) Le traitement des cellules PANC-1 avec 5 μM de 6-BIO a considérablement réduit l’invasion des cellules cancéreuses dans les essais d’invasion de Matrigel. Les essais d’invasion de Matrigel, y compris la collecte de données et les analyses, ont été réalisés de manière similaire à celle décrite dans la figure 2D. (D) Le knockdown de CAP1 dans les cellules PANC-1 a compromis l’effet du 6-BIO dans la réduction de la motilité cellulaire dans les essais de cicatrisation. Les clones PANC-1 stables témoins et ceux ayant subi un knockdown de CAP1 ont été cultivés pendant 16 heures après l’introduction de la plaie, et les lignes pointillées indiquent les bords de l’espace initial. La motilité cellulaire a été quantifiée, analysée à l’aide du test t de Student, et reportée dans le graphique où les barres d’erreur représentent l’écart-type. « * » indique P < 0,05 et « ** » indique P < 0,01.
Les mutants phosphorescents de CAP1 avaient des fonctions compromises dans l’atténuation des fibres de stress améliorées et la promotion du développement des lamellipodes dans les cellules PANC-1 CAP1-knockdown
Nos résultats des cellules CAP1-knockdown soutiennent que CAP1 est nécessaire pour la motilité et l’invasion des cellules cancéreuses, et les résultats de l’inhibition de GSK3 suggèrent que la phosphorylation S308/S310 joue un rôle clé dans les fonctions de CAP1. Nous avons ensuite employé une stratégie de réexpression pour établir plus précisément ces cas. Le CAP1 de type sauvage (WTCAP1) et les mutants phosphorés qui imitent les formes phosphorylées (S307D/S309D ; DD) ou non phosphorylables (S307A/S309A ; AA) du CAP1, tel que décrit précédemment12,18,24, ont été réexprimés de façon stable dans les cellules PANC-1 dont le CAP1 a été désactivé, afin de tester leur capacité à rétablir les phénotypes du cytosquelette d’actine et de la morphologie cellulaire. Ces mutants comportent des mésappariements à la séquence cible du shRNA S3 afin d’éviter la reconnaissance des ARNm dérivés par le shRNA présent de manière stable dans les cellules knockdown, mais sans altérer aucun acide aminé sur CAP112. Nous avons pu établir des clones stables qui réexpriment le CAP1 de souris WT, ou le mutant phosphoré AA et DD, comme le confirme le Western blotting contre le tag 6xHis (Fig. 4A). Notez que deux voies non pertinentes ont été retirées de l’image originale de Western blot (les échantillons dans ces deux voies ont été utilisés pour confirmer la réexpression de deux mutants de phosphore de la sérine 36 à l’extrémité N-terminale). L’ensemble des résultats du Western blot original est présenté dans la figure supplémentaire 1. La morphologie des cellules réexprimant le mutant AA (AA-R) ou DD (DD-R) a été examinée en microscopie de phase, et comparée à celle des cellules réexprimant WTCAP1 (WT-R). Il a été signalé que le knockdown de CAP1 dans certains types de cellules de mammifères, y compris HeLa et les cellules métastatiques du cancer du sein, a conduit à une augmentation significative de la taille des cellules12,13,18, un phénotype que nous avons précédemment confirmé comme étant spécifique au knockdown de CAP112,18. Le knockdown de CAP1 dans les cellules PANC-1 ou AsPC-1, cependant, n’a pas montré cet effet. Au contraire, la réexpression stable de WTCAP1 ou des mutants du phosphore dans les cellules knockdown a en fait augmenté de manière significative la taille des cellules (Fig. 4B). De plus, la réexpression de WTCAP1 a entraîné le développement de lamellipodes de taille robuste (indiqués par des flèches), une structure subcellulaire riche en actine filamenteuse et essentielle au mouvement directionnel des cellules (Fig. 4C), alors que pratiquement aucune des cellules knockdown hébergeant un vecteur de contrôle vide n’a développé de tels lamellipodes. Les mutants AA ou DD réexprimés ont également stimulé la formation de lamellipodes dans une certaine mesure, mais leur taille était nettement inférieure à celle des cellules réexprimant WTCAP1 (indiquée par des flèches sur la figure 4C). Nous avons compté 200 cellules pour chaque type de cellule, et les pourcentages de cellules qui abritent des lamellipodes de grande taille étaient les suivants : 0% (0/200) pour les cellules knockdown (Vec), 14,5% (29/200) pour les cellules WT-R, et 9% (18/200) et 7,5% (15/200), respectivement, pour les cellules AA-R et DD-R.
Effets de la réexpression de WTCAP1 et des mutants phosphorescents dans les cellules PANC-1 CAP1-knockdown sur le cytosquelette d’actine, la taille des cellules et le développement des lamellipodes. (A) Confirmation de la réexpression de WTCAP1 et des mutants phosphorescents AA et DD dans les cellules stables PANC-1 S3-3 CAP1-knockdown par Western blotting en utilisant l’anticorps contre le tag 6xHis. Deux voies non pertinentes ont été supprimées de l’image originale de Western blot (présentée dans la figure supplémentaire 1) ; (B) données quantifiées montrant une augmentation significative de la taille des cellules réexprimant WTCAP1 ou les mutants phosphorés dans les cellules CAP1-knockdown. Les tailles de 50 cellules par champ ont été mesurées en utilisant le programme Image-J. Les données ont été analysées à l’aide du test t de Student, et représentées dans le graphique où les barres d’erreur indiquent l’écart type. « * » indique P < 0,05 par rapport aux cellules témoins hébergeant le vecteur vide (Vec-R). (C) Les images de phase montrent que la réexpression de WTCAP1 ou des mutants du phosphore a stimulé la formation de lamellipodes. Certaines des cellules réexprimant WTCAP1 (WT-R) ont développé des lamellipodes de très grande taille (indiqués par des flèches). La réexpression du mutant AA (AA-R) ou DD (DD-R) a également simulé la formation de lamellipodes, mais leur taille est nettement inférieure à celle des cellules réexprimant WTCAP1. Aucun lamellipode de ce type n’a été observé dans les cellules CAP1-knockdown témoins hébergeant le vecteur vide (Vec-R). (D) La réexpression de WTCAP1 dans les cellules PANC-1 dont le CAP1-knockdown a réduit les fibres de stress, tandis que les cellules réexprimant les mutants ont augmenté les fibres de stress. Les cellules qui réexpriment le mutant DD phosphoromimétique présentent les fibres de stress les plus importantes. Les flèches indiquent les fibres de stress, ou leur absence dans le cas des cellules WT-R.
Nous avons ensuite examiné les capacités des mutants phosphorés à atténuer les fibres de stress renforcées dans les cellules PANC-1 désactivées par CAP1. Comme le montrent les images confocales de la figure 4D, la réexpression de WTCAP1 (WT-R) a permis d’atténuer efficacement les fibres de stress renforcées, ce qui a permis de sauver le phénotype, et les fibres de stress ont été dissoutes dans de grandes zones indiquées par une flèche. En revanche, les mutants phosphorescents étaient moins efficaces pour atténuer les fibres de stress renforcées. Les cellules réexprimant le mutant AA avaient des fibres de stress légèrement plus importantes que les cellules sauvées par WTCAP1, tandis que les cellules réexprimant le mutant DD semblaient avoir des fibres de stress encore plus importantes. Ces résultats sont cohérents avec nos découvertes précédentes sur les cellules HeLa qui suggèrent que le CAP1 déphosphorylé est la forme » active » par rapport au CAP124 phosphorylé, alors que la phosphorylation transitoire est supposée être requise pour les fonctions cellulaires optimales du CAP1. Ces résultats suggèrent également que la phosphorylation transitoire S308/S310 est importante pour que CAP1 régule le cytosquelette d’actine dans les cellules cancéreuses pancréatiques ; la perturbation de la régulation par la phosphorylation transitoire entraîne des défauts dans la fonction de CAP1 dans la promotion du renouvellement des filaments d’actine.
Les mutants phosphorés de CAP1 présentaient des défauts de sauvetage de l’invasivité réduite dans les cellules cancéreuses CAP1-knockdown
Puisque le renouvellement dynamique des filaments d’actine est la principale force motrice du mouvement cellulaire, nous avons ensuite testé dans quelle mesure les mutants phosphorés sauvent la motilité et l’invasion cellulaires réduites dans les cellules PANC-1 CAP1-knockdown. Nous avons d’abord effectué des essais de migration Transwell, et nous avons constaté que la réexpression de WTCAP1 augmentait significativement la motilité des cellules par rapport aux cellules témoins qui hébergent un vecteur vide, comme le montrent les résultats quantifiés dans le graphique (Fig. 5A). Le mutant AA réexprimé (AA-R), bien qu’il ne soit pas aussi efficace que WTCAP1, a partiellement corrigé la motilité réduite des cellules dans les essais de migration Transwell. En revanche, le mutant DD (DD-R) n’a pas réussi à corriger la réduction de la motilité cellulaire, et le taux était comparable à celui des cellules CAP1-knockdown hébergeant un vecteur vide. Ces résultats sont cohérents avec les capacités de sauvetage des fibres de stress améliorées par WTCAP1 et les mutants phosphorescents. Nous avons également testé le sauvetage de l’invasion réduite du Matrigel dans les cellules CAP1-knockdown, comme le montrent les résultats quantifiés de la figure 5B. De même, WTCAP1 a sauvé le plus efficacement la réduction de l’invasion dans les cellules PANC-1 dont CAP1 a été éliminé ; le mutant AA a obtenu un sauvetage partiel tandis que le mutant DD n’a littéralement pas réussi à sauver le phénotype. Enfin, la réexpression de WTCAP1 dans les cellules CAP1-knockdown a également réduit l’expression d’E-Cadherin (Fig. 5C), ce qui confirme que CAP1 est nécessaire à la TEM dans les cellules cancéreuses PANC-1. Ensemble, ces résultats soutiennent que la phosphorégulation par le site en tandem S308/S310 joue un rôle important pour que CAP1 favorise la motilité et l’invasion des cellules cancéreuses pancréatiques.
Effets de WTCAP1 et des mutants phosphorescents dans le sauvetage de la motilité et de l’invasion réduites dans les cellules PANC-1 knock-down CAP1. (A) WTCAP1 et le mutant AA ont efficacement sauvé la motilité réduite dans les cellules PANC-1 désactivées par CAP1 dans les essais de migration Transwell, tandis que le mutant DD n’a pas réussi à le faire. Les expériences, la collecte des données et les analyses ont été menées de manière similaire à celle décrite dans la figure 2. Les barres d’erreur représentent les S.E.M., et « * » indique P < 0,05 par rapport aux cellules témoins hébergeant un vecteur vide (Vec-R). (B) WTCAP1 et le mutant AA sauvent efficacement l’invasion réduite du Matrigel des cellules PANC-1 dont CAP1 a été supprimé, tandis que le mutant DD n’y parvient pas non plus. Les expériences, la collecte des données et les analyses ont été menées de manière similaire à celle décrite dans la figure 2. Les barres d’erreur représentent les S.E.M., et « * » indique P < 0,05 par rapport aux cellules témoins. (C) La réexpression de WTCAP1 a également sauvé l’E-Cadhérine régulée à la hausse dans les cellules PANC-1 de CAP1-knockdown.
Preuves soutenant que CAP1 médiatise les signaux des facteurs de croissance extracellulaires pour contrôler l’invasivité des cellules cancéreuses
Les stimuli physiologiques, tels que les facteurs de croissance PDGF et HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, sont connus pour stimuler le réarrangement du cytosquelette d’actine et la migration cellulaire. Puisque la phosphorylation à S308/S310 est cruciale pour les fonctions de CAP1 dans la régulation du cytosquelette d’actine et de l’invasivité des cellules cancéreuses, nous avons étudié la possibilité que ces stimuli puissent réguler la phosphorylation de CAP1, et par ce biais contrôler le réarrangement du cytosquelette d’actine et l’invasivité des cellules cancéreuses. Il est intéressant de noter que le traitement des cellules PANC-1 et AsPC-1 privées de sérum avec le PDGF a réduit la phosphorylation S308/S310 sur CAP1, de façon remarquable au bout de 5 minutes (Fig. 6A,B). Le traitement des cellules cancéreuses pancréatiques avec du HGF ou du sérum n’a pas eu d’effet considérable sur l’induction de la déphosphorylation de CAP1 (Fig. 2 supplémentaire ; montré pour les cellules PANC-1). Par conséquent, la signalisation par CAP1 est probablement au moins partiellement responsable de la stimulation par le PDGF de la réorganisation du cytosquelette d’actine et de l’invasivité des cellules cancéreuses. Ces résultats sont également cohérents avec l’idée que la CAP1 déphosphorylée est la forme » active « , comme le suggèrent de multiples sources de données, notamment la liaison à la cofiline, la localisation subcellulaire des mutants phosphorés et la phosphorylation élevée de la CAP1 dans les cellules cultivées en suspension24. Cependant, la phosphorylation transitoire au niveau du site de régulation en tandem, à savoir le cycle entre les formes phosphorylée et déphosphorylée, est censée être requise pour les fonctions cellulaires optimales de CAP124. Les signaux de déphosphorylation de CAP1 fonctionnent probablement en cohorte avec les signaux de phosphorylation de CAP1, pour réguler les fonctions cellulaires de CAP1 en conduisant la phosphorylation transitoire à S308/S310.
La déphosphorylation de CAP1 induite par lePDGF dans les cellules cancéreuses pancréatiques. (A) Le traitement des cellules cancéreuses AsPC-1 privées de sérum avec le PDGF a induit la déphosphorylation de CAP1 à S308/S310. Les cellules ont été cultivées pendant la nuit, privées de sérum pendant 24 heures, puis traitées avec 30 ng/ml de PDGF pendant les durées indiquées. Des lysats cellulaires ont été préparés et utilisés pour le Western blotting avec un anticorps spécifique de phosphore qui détecte les signaux de phosphore sur les deux résidus du site régulateur en tandem sur CAP1. L’effet de déphosphorylation était le plus significatif au bout de 5 minutes de traitement par PDGF. (B) Le traitement des cellules PANC-1 privées de sérum avec le PDGF a également induit une déphosphorylation remarquable de CAP1, de manière similaire aux cellules AsPC-1. Le traitement des cellules et le Western blotting ont été réalisés selon les mêmes procédures que celles utilisées pour les cellules AsPC-1. La GAPDH a servi de contrôle de chargement dans le Western blot.
La déplétion de CAP1 dans les cellules cancéreuses pancréatiques a réduit l’activité FAK mais n’a pas provoqué d’altérations de l’ERK ou de la prolifération cellulaire
Nous avons récemment identifié un nouveau rôle pour CAP1 dans la régulation de la prolifération des cellules cancéreuses du sein, où la déplétion de CAP1 exerce des effets dépendants du contexte cellulaire sur la prolifération, accompagnés d’altérations cohérentes de l’activité ERK18. Nous avons testé si CAP1 pouvait également réguler ERK et la prolifération dans les cellules cancéreuses pancréatiques. Aucune altération significative de l’expression ou de la phosphorylation de ERK n’a été détectée dans les clones stables PANC-1 dont CAP1 a été supprimé, par rapport aux cellules témoins (figure supplémentaire 3A). Nous avons également effectué des tests MTT pour tester la prolifération des cellules stables S2-1 et S3-3 knockdown et les comparer à celle des cellules témoins (Vec), et nous avons détecté des taux de prolifération cellulaire légèrement inférieurs dans les cellules knockdown (figure supplémentaire 3B). Toutefois, les différences étaient statistiquement non significatives, les valeurs P comparant la D.O. (à 570 nm) entre les cellules S2-1 et les cellules témoins à 0,219, et celle entre les cellules S3-3 et les cellules témoins à 0,223. Ces résultats indiquent que CAP1 ne joue pas un rôle significatif dans la régulation de la prolifération des cellules cancéreuses du pancréas. En outre, étant donné la tendance générale que le paradigme de knockdown stable est sujet à des variations de clones, nous avons généré des pools de cellules PANC-1 knockdown stable de CAP1, qui sont censés refléter plus précisément les effets de la déplétion de CAP1 sur ERK, en évitant l’influence potentielle du biais de sélection. Comme le montre la figure 7A, des pools de cellules PANC-1 stables avec un knockdown efficace de CAP1, dérivés des constructions shRNA S2 et S3, ont été établis après sélection à la néomycine, comme le confirme le Western blotting. Conformément aux résultats de l’utilisation de clones stables knockdown, aucune altération remarquable de l’expression de ERK ou de sa phosphorylation n’a été détectée dans les cellules du pool knockdown par rapport aux cellules du pool témoin.
Les cellules du pool PANC-1 knockdown CAP1 présentaient une activité FAK et une adhésion cellulaire réduites, mais aucune altération de ERK. (A) Les cellules de pool PANC-1 réduites en CAP1, dérivées des constructions shRNA S2 et S3, n’ont pas montré d’altération de l’expression ou de l’activité ERK par rapport aux cellules de pool de contrôle hébergeant un vecteur vide, comme détecté dans le Western blotting. L’activité ERK a été détectée en Western blotting à l’aide d’un anticorps phosphore-spécifique contre les sites Thr202/Tyr204. La GAPDH a servi de contrôle de charge. (B) Une activité FAK réduite a été détectée dans les cellules PANC-1 de pool CAP1-knockdown par rapport aux cellules de pool de contrôle. L’activité de FAK a été évaluée par phosphorylation à Tyr397, en utilisant un anticorps spécifique de phosphore contre le site dans le Western blotting ; (C) Les cellules du pool CAP1-knockdown avaient une adhésion cellulaire réduite aux points de temps testés (45 minutes et 2 heures) après le placage des cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine. Environ 2 × 104 cellules ont été placées dans chaque puits d’une plaque à 6 puits, et les cellules non fixées aux moments indiqués ont été lavées. Le nombre de cellules fixées a été compté dans cinq champs aléatoires sous un microscope à phase et des images ont été prises. (D) Les données recueillies à partir de trois essais indépendants d’adhésion cellulaire ont été analysées à l’aide du test t de Student, et reportées sur le graphique où les barres d’erreur représentent l’écart-type. « ** » Indique P < 0,01 par rapport aux cellules témoins hébergeant le vecteur vide.
Le knockdown de CAP1 dans les cellules de cancer du sein a provoqué des altérations distinctes de FAK dans les cellules de cancer du sein métastatiques et non métastatiques18. Nous avons également détecté une activité réduite de FAK, sans altération des niveaux d’expression de FAK, dans les cellules cancéreuses PANC-1 de pool CAP1-knockdown (Fig. 7B). Sur la base de ces résultats, nous avons ensuite testé les effets de la déplétion de CAP1 sur l’adhésion cellulaire dans des essais d’adhésion, de la même manière que nous l’avons fait précédemment12,18. Nous avons constaté que les cellules des pools de CAP1-knockdown dérivées des deux constructions shRNA présentaient une adhésion cellulaire remarquablement réduite par rapport aux cellules témoins (Fig. 7C). Aux deux points dans le temps (45 minutes et 2 heures) après que les cellules aient été placées sur une surface recouverte de fibronectine, beaucoup plus de cellules témoins se sont attachées par rapport aux cellules du pool CAP1-knockdown. En outre, un plus grand nombre de cellules témoins attachées s’étaient également complètement étalées (développement de lamellipodes et cellules moins brillantes) par rapport aux cellules CAP1-knockdown (Fig. 7C). Nous avons noté le nombre de cellules attachées dans trois champs pour comparaison, et les données de trois expériences indépendantes ont été quantifiées comme indiqué dans le graphique (Fig. 7D).