La structure d’une adénylyl cyclase membranaire liée à une protéine G stimulatrice activée

Les adénylyl cyclases (ACs) intégrées à la membrane sont des protéines clés dans la transduction du signal des mammifères, répondant à un large éventail de signaux extracellulaires et intracellulaires et générant de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) pour une gamme d’événements de signalisation en aval (1, 2). Les AC membranaires intègrent de multiples cascades de signalisation – par exemple, en reliant les entrées des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les changements dans les concentrations intracellulaires de Ca2+ (3) et les cascades de signalisation lipidique (4). Il existe neuf sous-types d’AC chez les mammifères, classés comme AC1 à AC9 (5). Sur la base de la séquence d’acides aminés, tous les sous-types d’AC partagent la même architecture globale prédite. Ce sont des protéines membranaires polytopiques, composées de 12 hélices transmembranaires (TM) et présentant des extrémités N et C cytosoliques. Les six premiers domaines TM (TM1-TM6) du polypeptide AC sont suivis d’une région cytosolique qui comprend un domaine catalytique (C1a), suivi d’un domaine C1b, la deuxième région TM, le faisceau TM7-TM12, puis un deuxième domaine catalytique (C2a) et un domaine C2b C-terminal. Les parties N- et C-terminales des protéines sont très variables, alors que les parties les plus conservées sont les domaines C1a et C2a, qui appartiennent aux nucléotidyl cyclases de classe III (5, 6). La cristallographie aux rayons X d’un chimère AC5C1/AC2C2 dans un complexe avec la sous-unité stimulante de la protéine G Gαs (7, 8) a révélé les caractéristiques clés de la machinerie catalytique des AC et a contribué à la formulation d’un mécanisme détaillé de la production d’AMPc par les AC dépendant de la protéine G (7, 8). Cependant, chacune des ACs membranaires de mammifères comprend des éléments structurels supplémentaires, tels que le domaine membranaire et le domaine hélicoïdal (HD), qui sont essentiels pour l’assemblage correct de ces protéines et pour leur fonction enzymatique.

Avec le clonage de la première AC de mammifère est venue la suggestion que les ACs pourraient ressembler à des transporteurs (9). Les premières études des ACs chez la paramécie ont suggéré que la portion TM de la protéine pouvait avoir une fonction de canal ionique (10). En accord avec leur fonction de canal, la séquence de la portion TM des ACs de Paramecium est homologue à celle des canaux de potassium voltage-dépendants (11). La présence d’un faisceau d’hélices TM polytopique et le domaine cytosolique de liaison à l’adénosine 5′-triphosphate (ATP) laissent entrevoir une similarité structurelle et fonctionnelle superficielle avec les transporteurs ABC (ATP-binding cassette). Cependant, il n’y a pas de similarité de séquence substantielle entre les CA et les protéines connues de type transporteur ou de type canal ionique. Des études sur les ACs de mycobactéries et de mammifères ont indiqué un rôle possible des domaines TM dans l’assemblage correct de l’enzyme (7, 12, 13). Cependant, le rôle structurel et fonctionnel de la région TM reste peu clair.

AC9 est un sous-type de cyclase exprimé dans de nombreux tissus, y compris les poumons, le cerveau et le cœur (14, 15). Elle a été largement étudiée en conjonction avec les complexes de la protéine d’ancrage de l’A-kinase (AKAP) (16). Il a été proposé que l’AC9 soit lié par l’AKAP Yotiao avec les canaux potassiques IKs, la protéine kinase A, la phosphodiestérase PDE4D3 et la protéine phosphatase PP1 (17). L’AC9 a été identifié comme une cible médicamenteuse potentielle dans l’asthme (5). Le rs2230739, un polymorphisme de l’AC9 qui entraîne une mutation Ile772→Met, est associé à des changements dans la réponse au corticostéroïde inhalé budésonide (18). Dans un modèle canonique d’activation de l’AC, la forskoline se lie à un site allostérique adjacent au site catalytique, ce qui entraîne l’activation de l’enzyme. L’interaction entre l’AC et la sous-unité Gαs dans un état lié à la guanosine 5′-triphosphate (GTP) conduit également à l’activation de l’AC, l’activation maximale de l’AC étant obtenue en présence à la fois de la forskoline et de la protéine Gαs. Cependant, bien que les comparaisons de séquence avec d’autres ACs montrent que l’AC9 contient un site allostérique et qu’un rapport précédent ait suggéré que la forskoline peut activer l’AC9 (14), plusieurs études ont conclu que l’AC9 est insensible à la forskoline et le consensus dans le domaine a été que l’AC9 se tient dans sa propre catégorie en tant que protéine insensible à la forskoline (19, 20).

Les ACs sont longtemps restées une pièce manquante dans notre compréhension de la transduction du signal, probablement en raison des difficultés reconnues pour exprimer et purifier ces protéines pour des études biochimiques et structurelles (21). Pour combler cette lacune, nous avons déterminé la structure de l’AC9 bovin en complexe avec Gαs (AC9-Gαs) en utilisant la microscopie cryo-électronique (cryo-EM) et l’analyse de particules uniques.

Nous avons exprimé et purifié l’AC9 bovin (fig. S1A) et confirmé son intégrité fonctionnelle en utilisant des essais d’accumulation d’AMPc (Fig. 1, A à C). La protéine purifiée catalysait la conversion de l’ATP en AMPc et pouvait être inhibée par le MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-méthylanthraniloyl)guanosine-5ʹ-O-triphosphate), un analogue inhibiteur du substrat de l’AC (Fig. 1B). La reconstitution de la protéine avec les Gαs activés par le GTPγS (fig. S1, B et C) a conduit à une activation robuste de la cyclase (Fig. 1A). Des tests de la capacité de l’activateur universel de l’AC, la forskoline, à activer l’AC9 in vitro ont révélé une très faible activation de l’AC9 à des concentrations submillimolaires (Fig. 1A). En revanche, la forskoline pouvait activer le complexe AC9-Gαs avec une concentration efficace médiane (EC50) de 111 μM (Fig. 1A et tableau S2). Ainsi, bien que la forskoline et la sous-unité Gαs étaient toutes deux capables d’activer partiellement la protéine, l’activation complète ne pouvait être atteinte qu’en combinant les deux agents. De plus, comme on pouvait s’y attendre de la part d’un modulateur allostérique de l’AC, la forskoline a déplacé la concentration inhibitrice médiane (IC50) de l’analogue du substrat de l’AC9, le MANT-GTP, vers la plus faible concentration (Fig. 1, B et C). Par conséquent, nos expériences in vitro utilisant l’AC9 pleine longueur purifiée et la protéine Gαs montrent clairement que la forskoline agit sur le complexe protéique AC9-Gαs comme un activateur allostérique classique.

Nous avons préparé des grilles cryo-EM congelées et hydratées contenant le complexe AC9-Gαs en présence de MANT-GTP et de forskoline à des concentrations (0,5 mM pour chaque ligand) dépassant les valeurs IC50 et EC50 pour ces deux composés et les avons soumises à une analyse cryo-EM à une seule particule (fig. S2). Le meilleur sous-ensemble de particules a donné une carte de densité correspondant au complexe complet de la cyclase et de la sous-unité de la protéine G, affinée à une résolution de 3,4 Å (Fig. 1D). La carte de densité complète, ainsi que les cartes obtenues après raffinement ciblé des parties membranaires (fig. S3) et cytosoliques (fig. S3) du complexe, nous ont permis de construire un modèle tridimensionnel (3D) complet du complexe AC9-Gαs (Fig. 1E). La carte et le modèle ont révélé plusieurs éléments clés du complexe AC9-Gαs : (i) le faisceau de domaines 12-TM d’AC9, (ii) le HD reliant le faisceau TM et le domaine catalytique d’AC9, et (iii) le domaine catalytique d’AC9, lié à la sous-unité Gαs activée par GTPγS (Fig. 1, D et E, et fig. S6).

Le domaine TM de la protéine possède une symétrie pseudo-double, une caractéristique que l’on retrouve souvent dans les transporteurs de solutés de la division de la nodulation de résistance, ABC, ou de la famille des facilitateurs majeurs (Fig. 2, A à C). Les hélices transmembranaires TM1-TM6 et TM7-TM12 peuvent être superposées avec un écart quadratique moyen (RMSD) de 3,4 Å sur 176 résidus (Fig. 2D). La pseudo-symétrie interne soutient l’hypothèse que les ACs membranaires des mammifères sont apparus par un événement de duplication de gènes à partir d’un système simple, probablement similaire à celui de la  » demi-cyclase  » Cya/Rv1625c de Mycobacterium tuberculosis (12). L’interface entre les deux moitiés TM d’AC9 est formée par les hélices TM1, TM4, et TM6 dans la « moitié » N-terminale du faisceau de domaines TM et TM7, TM10, et TM12 dans la partie C-terminale de la protéine (Fig. 2, B et C). Le clonage du premier gène AC de mammifère a été accompagné d’une suggestion selon laquelle les ACs pourraient agir comme des transporteurs, sur la base de leur séquence primaire (9). Notre structure ne révèle aucune voie évidente de translocation de soluté putative dans le faisceau de domaines TM, avec les hélices TM de l’AC9 serrées les unes contre les autres. Bien qu’une micelle de digitonine fournisse probablement un environnement similaire à celui de la bicouche lipidique, il est possible que la conformation des hélices TM dans l’environnement physiologique de la membrane soit différente.

Les hélices TM6 et TM12 de l’AC9 s’étendent dans le cytosol, formant des HD de 40 résidus de long, appelés ici HD1 (incluant les hélices h1.1 et h2.1) et HD2 (hélices h2.1 et h2.2 ; Fig. 2, E et F). Cette région est importante pour la fonction des ACs et des guanylyl cyclases chez les procaryotes et les eucaryotes (12). Les résidus Leu323 à Met333 de l’hélice h1.1 et Ile1022 à Leu1032 de l’hélice h2.1 forment une bobine enroulée classique (Fig. 2F). Nous avons précédemment décrit le HD de Cya, un AC membranaire de Mycobacterium intracellulare homologue au Rv1625c de M. tuberculosis (12). Le HD de l’AC9 présente quelques différences par rapport à celui de Cya dans l’arrangement relatif de la région centrale à la limite avec le domaine catalytique (Fig. 2, E et F, et fig. S7, A et B). Dans M. intracellulare Cya, les hélices courtes sont étroitement liées à l’extrémité C de la bobine enroulée (fig. S7B). En revanche, la bobine spiralée de l’AC9 se déroule aux extrémités C-terminales de h1.1 et h2.1 (Fig. 2F, fig. S7B, et fig. S8A). Cette région de l’enzyme est critique pour la fonction des ACs et des guanylyl cyclases. Les mutations liées aux maladies génétiques sont cartographiées sur les HD de l’AC5 dans la dyskinésie familiale et la myokymie faciale (22, 23) et sur celles de la guanylyl cyclase rétinienne (retGC1) dans l’amaurose congénitale de Leber-1 (24) et la dystrophie des cônes et des racines-6 (CORD6) (25). Nous pouvons maintenant affiner les positions des mutations liées à la maladie en utilisant la structure de l’AC9 bovine, une approximation beaucoup plus proche des nucléotidyl cyclases liées à la pathologie humaine par rapport à la Cya de M. intracellulare.

La fonction du faisceau 12-TM dans les AC des mammifères n’était pas claire. Des études récentes sur le Rv1625c mycobactérien ont suggéré une possible fonction de récepteur pour la région membranaire de l’homologue mycobactérien (12). Nous n’avons pas pu résoudre des parties de la surface extracellulaire de l’AC9 (Fig. 2, A et B), et il n’est pas clair si la partie de la protéine liée à la membrane abrite des sites de liaison fonctionnellement pertinents pour des ligands hypothétiques. De même, le domaine C1b qui relie le domaine catalytique C1a au TM7 n’a pas pu être résolu dans notre reconstruction (fig. S6, E à G). Cependant, notre structure fournit des indices sur la façon dont les interactions avec la région membranaire pourraient influencer la fonction catalytique de la protéine. Les hélices TM6 et TM12 sont en continuité avec h1.1 et h2.1 dans le HD. TM6 et TM12 sont situées à l’interface des faisceaux hélicoïdaux TM1-TM6 et TM7-TM12 et sont exposées latéralement à la bicouche lipidique (Fig. 2E et fig. S8B). Il est concevable que des interactions directes de TM6 ou TM12 avec des lipides, des petites molécules ou d’autres protéines puissent influencer directement le domaine catalytique en modifiant l’orientation des hélices h1.1 et h2.1 (fig. S8B).

Le domaine catalytique complet de l’AC9 est composé de deux moitiés, C1a et C2a (Figs. 1E et 3A), similaires aux structures radiographiques précédemment résolues des domaines solubles des AC membranaires (fig. S7, A et C). Comme cela a été montré précédemment, la principale interface d’interaction entre la sous-unité α de la protéine G et le domaine catalytique d’AC9 est formée par l’insertion de l’hélice Switch II de Gαs dans le sillon formé par les hélices α′2 et α′3 du domaine C2a d’AC9 (fig. S7, D à F). La région HD h1.2 (résidus 340 à 360) est à proximité de la surface d’interaction avec les Gαs (fig. S7E). Cette région de la protéine semble être très dynamique, et nous n’avons pas pu résoudre les résidus reliant His361 et Pro384 de AC9 (fig. S7E). Néanmoins, la proximité de cette région avec l’interface protéine G-AC suggère que cet élément de la structure d’AC9 contribue probablement à l’interaction entre AC9 et Gαs.

Un élément de forte densité situé au sein du site de liaison à l’ATP et du site à la forskoline a été détecté (figure 3, A et B, et fig. S9, A à C). Cette densité présentait une similitude superficielle avec la densité du MANT-GTP mais ne correspondait pas à son emplacement attendu (Fig. 3A). La densité dans le site de la forskoline semblait chevaucher la position attendue de la forskoline (Fig. 3A). Une caractéristique de densité similaire était présente dans la carte reconstruite à partir des images de l’échantillon dépourvu de forskoline (Fig. 3B et fig. S9B). Par conséquent, indépendamment de la présence de MANT-GTP et/ou de forskoline, les sites actifs et allostériques semblent être occupés par une densité correspondant à un peptide (Fig. 3, A et B, et fig. S9, A et B). Une classification et un raffinement 3D ciblés ont révélé un lien entre cette densité et la région C-terminale du domaine C2a de l’AC9 (Fig. 3C et figs. S3 et S9C). Bien que les caractéristiques de densité dans cette classe 3D moins peuplée (carte SOL-C, calculée avec seulement 16 343 particules) ne soient pas suffisamment fortes pour construire avec confiance un modèle atomique de protéine, en utilisant la densité disponible comme une contrainte, nous avons pu l’attribuer aux résidus Cys1246 à Pro1275 de l’extrémité C-terminale d’AC9, ou domaine C2b (Fig. 3C et fig. S9C). La grande qualité de la densité à l’intérieur du site allostérique et du site actif (Fig. 3A et fig. S9, A et D) nous a permis de construire le modèle du peptide d’occlusion, correspondant aux résidus Ile1263 à Pro1275 du domaine C2b de l’AC9 (fig. S9D). Cette région est hautement conservée parmi les homologues vertébrés de l’AC9 (fig. S9E) mais pas dans les autres isoformes de l’AC (AC1 à AC8) (fig. S10).

Pour déterminer le rôle fonctionnel du domaine C2b dans l’AC9, nous avons comparé les propriétés enzymatiques du type sauvage et de la protéine tronquée dépourvue du domaine C2b AC91250 (Fig. 3D et fig. S11A). Les deux constructions ont montré une capacité comparable à convertir l’ATP en AMPc, avec des valeurs de constante de Michaelis (Km) et de Vmax similaires (Fig. 3E et tableau S2). AC91250 a été activé par la forskoline et inhibé par le MANT-GTP d’une manière similaire à celle d’AC9 (fig. S11, B à D). L’ajout de Gαs a puissamment stimulé la production d’AMPc par l’AC9 (fig. 3F), avec une augmentation concomitante de son Km pour l’ATP. Conformément à la queue inhibant la liaison de l’ATP, l’AC91250 a montré un Vmax élevé mais à une valeur de Km beaucoup plus faible (Fig. 3F). Ceci est une forte indication que la région C2b joue un rôle fonctionnel dans l’état lié à la protéine G de l’AC9. L’élimination de la région C2b augmente l’affinité de l’AC9 pour l’ATP en présence de Gαs, permettant à la protéine d’atteindre un taux maximal de catalyse à des concentrations d’ATP beaucoup plus faibles. La réduction de l’affinité pour le substrat (ATP) par l’occlusion du site actif par le domaine C2b peut représenter un mécanisme de régulation pour contrôler la production d’AMPc par l’AC9 liée à la protéine G.

Pour évaluer les changements conformationnels dans l’état d’occlusion de l’AC9, nous avons déterminé la structure cryo-EM du complexe AC91250-Gαs en présence de MANT-GTP et de forskoline (AC91250-Gαs-MF ; figure 3, G et H, et figs. S12 et S13). La reconstruction à une résolution de 4,2Å nous a permis de résoudre clairement la densité pour le MANT-GTP et la forskoline liés à leurs sites de liaison canonique (Figs. 3, G et H, et 4 ; fig. S13, E à G). La comparaison de l’arrangement du domaine catalytique des complexes AC91250-Gαs-MF et AC9-Gas a révélé un petit réarrangement relatif du C1a dépendant de la présence du peptide d’occlusion dans les sites actifs et allostériques (Fig. 4, A et B) ; la RMSD entre les atomes des domaines C1a mobiles (Ile1380 à Gln574) des deux structures comparées alignées à l’aide de leurs domaines C2a (Gln1049 à Lys1245) est de 1,9 Å. Le subtil mouvement du domaine entier observé dans l’état d’occlusion de l’AC9 déplace les résidus d’acides aminés du C1a impliqués dans la liaison du nucléotide de ~3 Å (fig. S13H). Par conséquent, le domaine catalytique central de l’AC9 adopte une conformation occluse, le peptide dérivé de C2b occupant les sites actif et allostérique de la protéine (fig. S9, D et E) concomitamment à une distorsion du site actif par rapport à celle observée dans l’état lié au MANT-GTP et à la forskoline.

La structure du complexe AC9-Gαs dans une conformation occluse nous a permis de revisiter le modèle établi de la transduction du signal basée sur l’AMPc (7, 26) (fig. S14). L’activation de la cascade de RCPG doit conduire à la formation de la forme de l’AC liée à la sous-unité Gαs pour générer de l’AMPc. Cependant, l’état occlus décrit ici ajoute un intermédiaire qui n’a pas été apprécié auparavant. L’état occlus et l’état actif de l’AC9 existent probablement dans un équilibre ; l’échantillon qui a produit la reconstruction de l’état occlus peut être activé par la protéine G et peut produire de l’AMPc. La réduction substantielle du Km de la protéine pour l’ATP (Fig. 3F) suggère en outre que l’occlusion du site ATP peut être favorisée en présence de la protéine G. De futures expériences permettront de définir le rôle fonctionnel de cette conformation de la protéine dans le cycle catalytique de l’AC9.

L’architecture de l’AC9 révélée dans cette étude fournit des indices sur le rôle possible des parties incorporées dans la membrane dans les ACs des mammifères. Une fonction apparente du domaine membranaire est de permettre l’assemblage correct de la cyclase active. Ceci est accompli par TM6 et TM12 qui fournissent le cadre pour le HD. Il est probable que les éléments de la protéine qui ne peuvent pas actuellement être résolus, c’est-à-dire l’extrémité N-terminale et le domaine C1b, contribuent à l’assemblage et à la régulation de la fonction cyclase de l’AC9 (fig. S6, E à G). Par conséquent, malgré la séparation du domaine catalytique de ~40 Å de la bicouche lipidique, il est concevable que la partie membranaire de la protéine puisse influencer le domaine catalytique via le HD et les régions de boucle adjacentes.

L’état occlus du complexe avec le peptide C-terminal liant à la fois le site actif et le site allostérique de l’AC9 peut représenter un important mécanisme d’autorégulation intégré dans le mécanisme de transduction du signal basé sur l’AC. La présence du peptide peut aider à expliquer les observations incohérentes de l’insensibilité de l’AC9 à la forskoline (14, 19, 20), soutenant l’autorégulation de l’AC9 en fonction du contexte. La forskoline est une petite molécule d’origine végétale qui active les ACs ; l’existence d’un activateur ou d’un inhibiteur naturel de ce site dans les ACs a été postulée (20) mais n’a pas encore été identifiée. Dans le cas de l’AC9, nous pouvons maintenant montrer que (i) la forskoline est capable d’activer l’enzyme et (ii) le régulateur naturel probable du site allostérique est la portion du domaine C2b qui se lie à la région active de la protéine. Nous suggérons que, après l’activation par la protéine G (fig. S14, A à D), le C2b occlut le centre de réaction de l’AC9 et bloque l’activité enzymatique, empêchant ainsi la production excessive d’AMPc dans la cellule (fig. S14E). Ceci est cohérent avec un rapport récent sur la fonction auto-inhibitrice du domaine C2b d’AC9 dans un contexte cellulaire (27). Nos résultats peuvent aider à ouvrir la voie à la génération de nouvelles approches dans la découverte de médicaments qui exploitent le mécanisme moléculaire autorégulateur révélé par la structure de l’AC9-Gαs.