Une chimère était une créature de la mythologie grecque généralement représentée comme un composite de lion, chèvre et serpent. L’utilisation contemporaine du terme « chimérisme » dans la transplantation de cellules hématopoïétiques dérive de cette idée d’une entité « mixte », se référant à une personne qui a reçu une greffe de tissus génétiquement différents. Un test de chimérisme après une greffe de cellules souches hématopoïétiques implique l’identification des profils génétiques du receveur et du donneur, puis l’évaluation de l’étendue du mélange dans le sang, la moelle osseuse ou d’autres tissus du receveur.
Le test de chimérisme (analyse de la prise de greffe) par ADN emploie une méthodologie couramment utilisée dans les tests d’identité humaine et est réalisé par l’analyse de polymorphismes génomiques appelés loci de répétition en tandem courts (STR). Ces loci consistent en une séquence d’ADN centrale répétée un nombre variable de fois dans un locus génétique discret. Le terme STR, également appelé microsatellites, fait référence au nombre de paires de bases d’une séquence d’ADN centrale répétée en tandem, dont la longueur varie de 2 à 8 paires de bases. Ces loci présentent des allèles dont la longueur peut varier d’un individu à l’autre et qui sont hérités en tant que caractères mendéliens codominants. Les loci STR ont été identifiés à travers le génome humain et certains loci ont plus de 25 allèles.
L’information sur la séquence d’ADN dans les régions flanquantes conservées des loci est utilisée pour créer des paires d’amorces oligonucléotidiques pour les STR. Ces amorces sont utilisées pour l’amplification par PCR (réaction en chaîne par polymérase) des échantillons à tester. Cette technique peut amplifier la séquence STR jusqu’à un milliard de fois, fournissant du matériel qui peut être séparé avec un gel électrophorétique ou par électrophorèse capillaire (EC). Le génotypage se fait par évaluation de la taille des fragments d’ADN. La référence à une échelle allélique peut être utilisée pour l’identification exacte des allèles STR.
Le système STR/CE basé sur la PCR présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes d’analyse. L’amplification de plusieurs loci STR peut être combinée (multiplexée) dans un seul tube, ce qui permet d’analyser jusqu’à seize loci en une seule réaction. Étant donné que des quantités infimes d’ADN sont nécessaires, des échantillons à faible nombre de cellules peuvent être utilisés, et la petite taille des allèles STR permet même d’utiliser des échantillons d’ADN dégradés. Les données numériques facilitent l’analyse et l’archivage, et le processus d’EC est à la fois rapide et rentable. L’amplification par PCR et l’analyse des loci STR constituent une méthode rapide et fiable pour l’évaluation de l’état de la prise de greffe dans le cadre de la transplantation de cellules souches.
La technologie actuellement utilisée permet la co-amplification et la détection tricolore de seize loci qui sont subdivisés en 3 ensembles de 5 ou 6 loci qui présentent des fragments amplifiés avec des gammes de taille ne se chevauchant pas.
Pendant l’étape d’amplification par PCR, les fragments amplifiés sont marqués avec des colorants fluorescents. Après l’amplification par PCR, les échantillons sont traités sur un système d’électrophorèse capillaire (EC).
L’analyse des données est facilitée par un logiciel d’analyse des fragments qui dimensionne les fragments d’ADN à l’aide d’un standard de voie interne exécuté avec l’échantillon et attribue des génotypes par comparaison avec une échelle d’allèles STR incluse dans l’exécution CE. On obtient ainsi des profils génotypiques STR distincts pour le donneur et pour le receveur de la greffe. Les loci STR qui sont polymorphes (c’est-à-dire informatifs) entre ces individus sont utilisés pour évaluer les quantités relatives d’ADN du receveur et du donneur dans l’échantillon post-transplantation.
Les échantillons testés peuvent provenir de tout matériel contenant de l’ADN, y compris la moelle osseuse, le sang périphérique, les tumeurs solides, le tissu épidermique, les follicules pileux, les écouvillons buccaux et les sous-ensembles cellulaires fractionnés. Étant donné que l’amplification PCR d’un échantillon est couramment réalisée avec moins de 2 ng d’ADN génomique (équivalent à environ 300 cellules), le test de chimérisme par cette méthode peut être réalisé avec succès même pour les patients présentant un échec de la greffe, une leucopénie sévère ou à partir de fractions de sous-ensembles de cellules hématopoïétiques. L’analyse STR a été utilisée pour évaluer le statut de prise de greffe des patients ayant reçu une greffe de cellules hématopoïétiques, y compris les patients ayant reçu des unités de sang de cordon double ou une deuxième greffe provenant d’un donneur différent, ainsi que pour confirmer l’identité génétique de jumeaux identiques présumés et pour détecter la prise de greffe de cellules maternelles dérivées in-utero chez les patients ayant reçu un diagnostic de déficit immunitaire combiné sévère (SCID). L’analyse STR/CE est une procédure rapide, fiable, précise et reproductible.
Limitations du test
- Une quantité suffisante d’ADN doit être isolée des échantillons à tester pour permettre une amplification PCR robuste. Les méthodes d’isolement de l’ADN doivent être disponibles pour traiter les échantillons à faible nombre de cellules, tels qu’ils pourraient être rencontrés chez les receveurs avec une défaillance du greffon et à partir des sous-ensembles de globules blancs triés spécifiques de lignage par cytométrie en flux. Les échantillons peuvent avoir des concentrations trop faibles pour être quantifiées par spectrophotométrie UV OD260. Les échantillons d’ADN provenant de 5 000 à 30 000 cellules isolées fournissent de manière fiable une amplification acceptable. Le laboratoire dispose de directives qui définissent quand l’analyse des échantillons doit être répétée.
- Avec les kits commerciaux, de nombreux loci STR ont des allèles informatifs pour le donneur et le receveur dans le cadre d’un don non apparenté. Cependant, le nombre de loci STR informatifs peut être limité à seulement 3 parmi les paires de transplantation de donneurs apparentés. Les valeurs quantitatives représentant la moyenne de seulement 3 loci STR se sont avérées reproductibles.
- Les patients atteints de maladies malignes peuvent présenter des mutations clonales qui ont un impact sur certains loci STR. Un allèle du patient peut être absent à un ou plusieurs loci STR lorsqu’on compare les allèles identifiés dans l’échantillon du patient avant la transplantation par rapport à l’échantillon après la transplantation. Dans de rares cas, un allèle STR supplémentaire du patient peut être détecté à un locus spécifique qui n’était pas présent dans l’échantillon pré-greffe. Dans la plupart des cas, ces anomalies sont probablement dues à des translocations chromosomiques. Les allèles manquants peuvent également être le résultat d’une mutation dans les séquences flanquantes conservées des STR où se trouvent les amorces PCR. Les données des loci STR avec des allèles manquants ou supplémentaires ne sont pas utilisées pour la quantification.
- Si les cellules pré-transplantation du patient ne sont pas disponibles, des échantillons tels que des écouvillons buccaux, une biopsie de la peau ou des racines de cheveux peuvent être collectés après la transplantation. Cependant, il convient de noter que les échantillons buccaux peuvent contenir des quantités significatives de cellules du donneur.
- Le test n’est pas destiné à la détection de la maladie résiduelle minimale.
Indications cliniques du test de chimérisme dans la transplantation de cellules hématopoïétiques
Documentation post-transplantation de routine de l’origine donneur/receveur des globules blancs dans le sang périphérique et/ou la moelle. La documentation de la prise de greffe peut inclure le test de sous-ensembles cellulaires spécifiques à la lignée, tels que les cellules T positives CD3 et les cellules myéloïdes positives CD33.
Évaluer les cellules du donneur/receveur chez les patients dont la fonction de la moelle est inadéquate.
Définir si une malignité récurrente ou nouvelle est issue des cellules du receveur ou du donneur.
Evaluer les risques pronostiques de rejet et de malignité récurrente.
Documenter la persistance des cellules du donneur après la transplantation chez les patients présentant une maladie récurrente ou avant la perfusion de lymphocytes du donneur (DLI).
Evaluer si un rejet du greffon s’est produit chez les receveurs candidats à une seconde transplantation.
Différencier l’origine des cellules du donneur chez les receveurs qui ont reçu une seconde transplantation avec un donneur différent ou une transplantation avec des unités doubles de sang de cordon.
Détecter la présence de cellules dérivées de la mère chez les patients diagnostiqués avec un déficit immunitaire combiné sévère (SCID).
Vérifier l’identité génétique de jumeaux identiques putatifs.
Frequently Asked Questions
Question : Comment analyser les donneurs multiples ?
Réponse : Il est essentiel d’identifier les loci STR qui présentent au moins un allèle STR unique pour le patient et chaque donneur.
Question : Pourquoi la prise de greffe maternelle est-elle testée ?
Réponse : Les patients diagnostiqués avec un déficit immunitaire combiné sévère (DICS) peuvent avoir subi une greffe de cellules hématopoïétiques d’origine maternelle in-utero. Certains sous-ensembles cellulaires spécifiques à un lignage (notamment les cellules CD3-positives) peuvent être principalement ou entièrement d’origine maternelle.
Question : Quelle est la différence entre le chimérisme « complet » et le chimérisme « mixte » ?
Réponse : « Le chimérisme « complet » est utilisé pour désigner un patient qui présente un phénotype post-transplantation dans les cellules hématopoïétiques qui est entièrement d’origine donneur.
Le chimérisme « mixte » désigne un patient qui présente un mélange de phénotype patient et donneur dans les cellules hématopoïétiques après la transplantation.
Question : Que faire si un échantillon de base du receveur n’est pas disponible ?
Réponse : Plusieurs options sont disponibles pour obtenir un échantillon de receveur après la transplantation : les échantillons de lingettes buccales, de racines de cheveux ou de biopsies cutanées peuvent être utilisés pour un échantillon de base de receveur. Les échantillons de lingettes buccales doivent être utilisés avec prudence car les cellules du donneur peuvent être présentes en quantités importantes dans les échantillons buccaux.
Question : Que faire si un échantillon de référence du donneur n’est pas disponible ?
Réponse : Si le donneur est vivant, obtenir un nouvel échantillon de sang. Si le donneur n’est pas vivant, les échantillons post-transplantation doivent être comparés à l’échantillon de référence pré-transplantation du patient afin d’identifier les allèles STR qui sont détectés mais qui ne sont pas d’origine patiente.
Question : Pourquoi le HLA n’est pas un moyen réalisable pour surveiller la prise de greffe ?
Réponse : Les donneurs de greffe sont choisis pour être aussi étroitement appariés au receveur que possible. Il n’y a pas de marqueurs HLA qui différencient le receveur et le donneur lorsqu’ils sont appariés, et seulement un ou deux s’ils sont mal appariés. De plus, d’autres technologies sont souvent plus sensibles à cet effet que le suivi des allèles HLA mésappariés ; par conséquent, d’autres loci sont utilisés pour fournir des profils uniques.
Question : Qu’est-ce qu’un locus STR informatif ?
Réponse : C’est un locus avec au moins un allèle unique au receveur ou au donneur. Pour être utile dans les calculs de chimérisme, un locus doit avoir des allèles uniques pour les deux. Il peut y avoir un grand nombre de locus informatifs lorsqu’un donneur non apparenté est utilisé pour la transplantation, mais très peu si un frère ou une sœur appariés sont utilisés. En raison des différences d’efficacité d’amplification des allèles à chaque locus, il est préférable d’obtenir des valeurs moyennes ou médianes de plusieurs loci pour améliorer la précision. Les résultats des loci individuels sont reproductibles de manière fiable, de sorte que même un seul locus peut être utilisé pour établir la tendance d’échantillons séquentiels.
Question : Qu’est-ce que le locus « amélogénine » qui est inclus dans certains panels d’amplification ?
Réponse : Le gène de l’amélogénine est localisé sur les chromosomes X et Y. Il ne s’agit pas d’une STR, mais il présente des produits de tailles différentes sur les chromosomes respectifs. Cela le rend utile pour déterminer le sexe. Il est inclus dans le panel d’amorces des vendeurs de kits commerciaux ciblant la communauté médico-légale où la différenciation X/Y est largement utilisée. Elle n’est généralement pas utilisée pour l’analyse du chimérisme car elle ne peut pas fournir un marqueur féminin unique (un échantillon masculin comprend toujours un allèle X) ; elle n’est pas non plus utile pour évaluer les échantillons après une greffe de cellules souches appariées selon le sexe.
Question : En quoi l’analyse du chimérisme STR diffère-t-elle du génotypage ?
Réponse : « Le génotype » fait référence aux allèles particuliers présents dans un locus spécifié. Le génotypage est effectué pour établir les profils du receveur et du donneur dans l’analyse du chimérisme. Lorsque l’analyse du chimérisme est effectuée après une greffe de cellules souches, les profils génotypiques du receveur et du donneur sont comparés au profil de l’échantillon post-transplantation pour évaluer la quantité de chaque composant présent.
Le génotypage est également utilisé dans d’autres scénarios tels que la médecine légale et les tests de filiation. Les analystes médico-légaux utilisent les génotypes pour identifier la source des preuves dans les affaires criminelles et pour exclure des personnes de la considération comme suspects. Ils peuvent également identifier des restes humains dans des affaires de type « John Doe » et lors de catastrophes de masse. Les déterminations de la filiation se font de manière similaire pour exclure quelqu’un comme parent possible en trouvant des allèles présents chez l’enfant qui ne correspondent ni à la mère ni au père putatif.
Littérature citée/Lecture recommandée
Bryant E, Martin PJ. Documentation de la prise de greffe et caractérisation du chimérisme après une transplantation de cellules hématopoïétiques. Dans : Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietic cell transplantation. 2nd ed. Malden, MA : Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.