L'albumine de sérum bovin augmente encore les effets des solvants organiques sur le rendement accru de la réaction en chaîne par polymérase des modèles riches en GC | BMC Research Notes

Parmi les fragments d’ADN que nous avons initialement tenté d’amplifier, seuls tlp2, che1P, et cheA1 (Tableau 1) ont produit un produit d’amplification PCR sans l’utilisation d’additifs de solvant, lorsque l’ADN génomique de A. brasilense a été utilisé comme modèle (Figure 1). Les effets du DMSO à 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % et 10 % (p/vol) ainsi que du formamide à des concentrations similaires comme additifs dans la PCR ont d’abord été testés (Figure 1). Un ensemble de PCR a également été réalisé avec de la BSA à 1-10 μg/μl (données non présentées). Conformément aux données de la littérature, alors que l’ajout de DMSO ou de formamide dans la PCR a favorisé l’augmentation du rendement d’amplification des fragments d’ADN de 2-3 kb, l’effet d’amélioration du DMSO était plus important que celui du formamide (Figure 1). Dans ces conditions, nous avons également observé que l’augmentation de la concentration de DMSO pouvait également entraîner une diminution de la spécificité de la PCR (Figure 2). D’autre part, l’effet du formamide sur l’augmentation du rendement de la PCR a diminué pour les fragments d’ADN plus grands qu’environ 2,5 kb (Figure 1). L’ajout de l’ASB seule comme additif de la PCR n’a pas eu d’effet significatif dans ces conditions, y compris aucun effet néfaste (données non présentées). Les effets d’amélioration de la BSA sur les rendements de la PCR ont été détectés lorsqu’elle est utilisée en combinaison avec le DMSO ou le formamide, sur une large gamme de tailles de fragments d’ADN (Figure 2). De plus, l’ajout de BSA a élargi la gamme de concentrations pour lesquelles le solvant organique pouvait être ajouté, même pour les matrices d’ADN de plus grande taille (Figure 2). Le consensus de la littérature actuelle sur le formamide indique qu’il est le plus efficace en tant qu’additif PCR lorsqu’il est utilisé à des concentrations allant de 0 à 5%, l’efficacité diminuant complètement à 10%. Nos résultats indiquent qu’en présence de BSA, le formamide est efficace au moins jusqu’à des concentrations de 10 % et avec des matrices d’ADN d’une taille maximale de 2,5 kb (tlp2) ; toutefois, il n’a pas réussi à favoriser l’amplification de fragments d’ADN de plus grande taille (figure 1). Ce résultat est cohérent avec l’effet rapporté du formamide comme étant le plus efficace pour les amplifications de gabarits d’ADN jusqu’à environ 2,5 kb et soutient davantage l’idée que le DMSO et le formamide améliorent les rendements de PCR par des mécanismes différents. Indépendamment de ces différences, l’ajout de BSA à cette PCR a semblé promouvoir et étendre les effets bénéfiques observés lorsque l’un des deux solvants était utilisé comme additif de la PCR. Étant donné les effets négatifs potentiels que des concentrations élevées de solvants organiques peuvent avoir sur des applications sensibles en aval, comme le séquençage ou le clonage, l’effet d’amélioration de l’ajout de BSA est significatif. Afin de mieux comprendre comment l’ASB pourrait agir comme un co-activateur avec le DMSO ou le formamide, nous avons analysé l’effet de son ajout sur le rendement de l’amplification sur 10, 15, 20, 25 et 30 cycles de PCR. Cette analyse a confirmé que l’ajout de DMSO ou de formamide, mais pas de BSA seule, à la PCR entraîne une augmentation du rendement (Figure 3). Lorsque la BSA a été utilisée comme co-activateur avec le DMSO ou le formamide, une augmentation du rendement a pu être détectée dans les 15 premiers cycles seulement pour tous les gabarits (Figure 3). Cette augmentation allait d’une augmentation de rendement de 10,5 % (che1P) à une augmentation de rendement de 22,7 % (cheA1) au cours des 15 premiers cycles. En outre, il a été constaté que la concentration effective de BSA augmentait avec la taille du fragment d’ADN amplifié jusqu’à une concentration maximale de BSA (10 μg/μl) où aucune autre augmentation du rendement n’a été détectée. En outre, aucune diminution du rendement n’a été observée même avec la plus grande concentration de BSA ajoutée dans ces conditions (figure 4). L’effet amplificateur de la BSA sur le rendement de la PCR, limité par le cycle, suggère que cette protéine peut se dénaturer avec le temps et perdre ainsi son efficacité. Pour tester cette hypothèse, une PCR a été mise en place dans laquelle du DMSO ou du formamide a été combiné avec de la BSA dans le tampon de réaction initial aux concentrations les plus efficaces déterminées ci-dessus, et exécutée pendant 10 cycles avant l’ajout d’une solution fraîche de BSA (0-10 μg/μl de concentration finale). L’ajout de BSA a été répété sur 30 cycles PCR et l’effet sur le rendement a été analysé comme décrit ci-dessus. Une augmentation soutenue du rendement a pu être détectée lorsque la BSA a été ajoutée à chaque dixième cycle de PCR : par exemple, lors de l’amplification de cheA1, une augmentation de près de 75 % du rendement de PCR par rapport à celui obtenu avec le solvant seul a été obtenue (Figure 4). Les résultats observés dans ce que nous appelons la méthode de » l’étape de PCR de BSA » sont cohérents avec l’hypothèse que la dénaturation de BSA cause la chute de l’effet d’augmentation du rendement après le quinzième cycle de PCR. Les expériences de contrôle où du glycérol ou de l’eau stérile distillée ont été ajoutés à chaque dixième cycle n’ont pas augmenté le rendement de la PCR, ce qui indique que les effets du BSA ne sont pas dus à un changement du volume de réaction ou au fait que le BSA agit effectivement comme un crowder moléculaire, une propriété attribuée à certains des effets du glycérol dans la PCR. Bien que les mécanismes exacts de l’effet d’amélioration du BSA sur le rendement de la PCR ne soient pas connus, les données obtenues ici et décrites dans la littérature soutiennent l’hypothèse que le BSA peut stabiliser l’ADN polymérase et/ou contrecarrer les effets inhibiteurs potentiels des concentrations élevées de solvants organiques sur l’activité de l’ADN polymérase. Pour l’amplification de cheA4, le fragment d’ADN avec le contenu GC le plus élevé utilisé dans cette étude (73%), une augmentation du rendement de la PCR a été obtenue en ajoutant la BSA ainsi que le DMSO à la PCR, mais de multiples produits d’amplification non spécifiques ont également été détectés (Figure 5). Pour résoudre ce problème, la méthode de l’étape de PCR à l’ASB a ensuite été utilisée en combinaison avec un protocole de PCR « Touchdown » qui s’est avéré précédemment améliorer la spécificité de la PCR. Cette méthode a produit une seule bande spécifique et a presque doublé le rendement obtenu en utilisant le protocole « Touchdown » et les solvants organiques seuls (augmentation de 96 %) (figure 5). Ces résultats nous ont également suggéré un moyen d’améliorer l’efficacité relativement faible de la méthode de mutagenèse dirigée par site sur plasmide entier décrite dans le kit de mutagenèse QuickChange Stratagene (Stratagene) pour introduire une mutation dans une matrice d’ADN riche en GC (ici le gène tlp2, un fragment de 2,5 kb de 66% GC). Lorsque nous avons utilisé le pUCtlp2 comme matrice pour la mutagenèse dirigée, avec des amorces mutagènes conçues pour introduire une substitution d’une seule paire de bases dans le tlp2 (amorces mutagènes conçues selon le site Web du fabricant) et le protocole du fabricant, le fragment de 5,324 kb correspondant au pUCtlp2 était à peine visible (Figure 5). Après avoir terminé le protocole de mutagenèse selon les instructions du fabricant, on a obtenu soit aucune colonie, soit un petit nombre de colonies (moins de 5 en moyenne) contenant des plasmides parentaux dépourvus de la mutation souhaitée. Ce type de résultat, caractérisé par un faible rendement de la mutagénèse, a été reconnu précédemment comme un écueil commun de cette méthode . Cependant, lorsque de la BSA a été ajoutée au tampon du fabricant toutes les cinq étapes, un produit d’amplification clair a été détecté (Figure 5). Après avoir suivi le protocole du fabricant, nous avons obtenu plus de 100 colonies dont 2/3 portaient la mutation souhaitée (déterminée par séquençage). Nous avons également appliqué l’étape de PCR BSA dans un protocole d’extension par recouvrement pour construire une protéine chimérique de fusion entre un gène A. brasilense (ATM, 650 pb) et la protéine fluorescente cyan (CFP) (720 pb). Dans la PCR d’extension par chevauchement, deux jeux de paires d’amorces sont d’abord utilisés pour amplifier deux fragments d’ADN à fusionner qui sont produits avec une courte séquence se chevauchant l’un l’autre. Une troisième amplification utilise les produits d’amplification des premières réactions comme modèles, ainsi que les amorces inverses et avant les plus extérieures pour générer des constructions chimériques . L’amplification des deux fragments d’ADN initiaux, ATM et CFP, a été très efficace en utilisant les protocoles PCR standard et aucune augmentation significative n’a pu être obtenue en utilisant le protocole de l’étape PCR de BSA (données non montrées). Cependant, la deuxième étape de PCR par chevauchement a produit de nombreux produits d’amplification non spécifiques et peu, voire aucun, amplicon chimérique souhaité (ATM-CFP ; tableau 1) (figure 5). Les produits d’amplification non spécifiques ont disparu lors de l’utilisation de la méthode PCR « Touchdown », mais l’amplicon chimérique spécifique souhaité est resté en très faible quantité, comme le montre une bande ATM-CFP très faible de 1 370 pb (Figure 5). L’utilisation de la méthode de l’étape de PCR de BSA avec un protocole « Touchdown » a permis d’augmenter de 72% le rendement de l’amplicon chimérique ATM-CFP (Figure 5). Le clonage et le séquençage ultérieurs ont confirmé que la construction chimérique correcte a été obtenue.

Tableau 1 Fragments d’ADN cible et amorces utilisés dans cette étude