Le domaine du pôle animal de l’oursin est un centre de structuration neurogène dépendant de Six3 | Développement

RESULTATS

Identification des gènes régulateurs candidats du domaine du pôle animal (APD)

Pour définir l’état de régulation précoce de l’APD dans l’embryon d’oursin, nous avons utilisé simultanément des approches bioinformatiques et expérimentales pour identifier les gènes codant pour des protéines régulatrices qui sont exprimées dans ce territoire avant la gastrulation. L’approche bioinformatique a exploité les efforts d’annotation des séquences du génome de notre laboratoire (Burke et al., 2006) et d’autres laboratoires (Howard-Ashby et al., 2006a ; Howard-Ashby et al., 2006b ; Materna et al., 2006 ; Tu et al., 2006), qui ont documenté les modèles d’expression de l’APD de nombreux gènes codant pour des facteurs de transcription et/ou qui étaient des orthologues de facteurs connus pour leur fonction dans le tissu neural chez les embryons d’autres espèces. L’approche expérimentale a comparé la représentation des ARN dans les embryons injectés d’ARNm de Δcadhérine par rapport aux embryons normaux au stade de la blastula. Les embryons dépourvus deβ-caténine nucléaire sont presque exclusivement constitués d’ectoderme du pôle animal, comme le montrent les profils d’expression de foxq2 et hbn. Chez les embryons normaux, ces ARNm sont limités au pôle animal à partir des stades blastula (Burke et al., 2006 ; Tu et al., 2006 ; Yaguchi et al., 2008) et les domaines de leur expression au stade mésenchyme blastula se chevauchent au pôle animal (Fig. 1B-D). Au fur et à mesure que le développement se poursuit au cours de la gastrulation, le domaine des cellules exprimanthbn forme un anneau qui entoure les cellules exprimantfoxq2 (Fig. 1F). Lorsque la signalisation Wnt, Nodal et BMP canonique est éliminée par l’injection de l’ARNm de la Δcadhérine, la moitié animale de l’embryon exprime foxq2 tandis que la majeure partie du reste de l’embryon exprime hbn (Fig. 1H). Ces modèles indiquent que les embryons dépourvus de signalisation canonique Wnt et Nodal-BMP2/4 sont presque entièrement constitués d’un APD considérablement élargi, dont les limites extérieures sont définies par l’expression de hbn. Les transcrits Foxq2 et hbn apparaissent dans l’APD pendant les stades de clivage tardif/ébauche de blastula,indiquant que la spécification de l’APD se produit au moins à ce moment.

Pour identifier les gènes régulateurs précoces de l’APD, nous avons comparé les concentrations relatives des ARNm individuels dans les embryons à ARNm de Δcadhérine par rapport aux embryons injectés de glycérol au stade de la blastula d’éclosion en utilisant un microréseau représentant toutes les prédictions génétiques trouvées dans la séquence du génome de l’oursin(Wei et al., 2006). Ce stade marque la transition entre le clivage et le début de la morphogenèse et se situe peu après le moment où les premiers marqueurs de l’APD ont été détectés (Burke et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008). Un ensemble de gènes codant pour des facteurs de transcription et des composants de voies de signalisation, dont l’expression était en moyenne au moins 3 fois plus élevée dans deux lots d’embryons ayant reçu l’ARNm deΔcadherin, a été identifié. Ces gènes recoupent partiellement l’ensemble des gènes candidats identifiés par l’approche bioinformatique. Les ensembles combinés contiennent 27 gènes et constituent un ensemble provisoire de gènes régulateurs de l’APD (E-APD)(tableau 1).

Afin d’identifier les gènes les plus précocement exprimés au sein de l’ensemble E-APD, nous avons examiné les profils d’expression temporelle générés par les puces à ADN, comme décrit précédemment (Wei et al, Les modèles ont été vérifiés par comparaison avec les données publiées (Burke et al., 2006 ; Croce et al., 2006 ; Howard-Ashby et al., 2006a ; Howard-Ashby et al., 2006b ; Materna et al., 2006 ; Sweet et al., 2002 ; Takacs et al., 2004 ; Tu et al., 2006 ; Yaguchi et al., 2008) et par nos hybridations in situ en montage entier (nos observations non publiées). Les gènes ont été classés en trois groupes : ceux qui sont représentés au maximum dans la population d’ARN maternel (Fig. 2A), ceux qui sont fortement régulés pendant les stades de clivage (Fig. 2B,C) et ceux qui sont régulés entre les stades de clivage tardif et de gastrula précoce (Fig. 2D). Nous nous sommes d’abord concentrés sur les membres du groupe d’expression embryonnaire précoce. Comme indiqué ci-dessous, en utilisant des essais de perte et de gain de fonction, nous en avons identifié un, Sp-Six3 (ci-après Six3), qui opère au sommet ou près du sommet de la hiérarchie de régulation des gènes APD.

Six3 est exprimé tôt dans l’APD

L’identification de l’oursin Six3 est sans ambiguïté car sa séquence est très fortement conservée dans le domaine homéodique (98% identique àHsSix3), le domaine six (91%) et le domaine d’interaction groucho (71%) (voirFig. S1 dans le matériel supplémentaire). Nous avons confirmé des études précédentes montrant que Six3 est exprimé dans un modèle dynamique pendant le développement de Paracentrotus lividus (Poustka etal., 2007), une espèce étroitement liée à Strongylocentrotuspurpuratus utilisé dans cette étude. Les caractéristiques les plus importantes sont que les transcrits Six3 sont exprimés dans l’hémisphère animal pendant le clivage tardif (Fig. 3A), dans l’APD au stade de la blastula éclose (Fig. 3B) et ensuite dans deux anneaux (Fig. 3G,H), l’un près de la périphérie de l’APD (Fig. 3C-F,H) et l’autre dans l’endomésoderme (Fig. 3C-G), pendant les stades de la blastula mésenchymateuse. Pendant la gastrulation, Six3 est exprimé dans certaines cellules du mésenchyme secondaire dispersées dans le blastocœle et à l’extrémité de l’archentéron (Fig. 3I, flèche), comme rapporté par Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), dans les cellules du pôle animal (Fig. 3I,J) et de l’ectoderme oral (Fig. 3J,K). Au stade pluteus,l’ARN Six3 est détecté dans deux groupes de cellules flanquant la bouche(Fig. 3K, flèches) et dans la bande ciliée (Fig. 3K).

Les niveaux globaux d’ARNm Six au stade mésenchyme précoce blastula ne changent pas significativement lors de l’injection d’ARNm de Δcadhérine(Tableau 1). Les hybridations in situ sont cohérentes avec ce résultat et montrent que la distribution diffère dans les embryons injectés d’ARNm de Δcadhérine, étant absente des cellules végétales et conservant la large expression de l’hémisphère animal qui est établie avant la restriction par des processus dépendant de Wnt canonique (voir Fig. S2 dans le matériel supplémentaire).

La fonction de Six3 est nécessaire pour la formation de l’APD et la différenciation des neurones

Pour tester la fonction de Six3, nous avons injecté dans des œufs fécondés deux morpholinos différents bloquant la traduction de Six3, chacun d’entre eux provoquant les mêmes défauts de développement. Les embryons à 3 jours ont adopté une morphologie arrondie (Fig. 4A,B) et les spicules étaient soit réduits soit absents. L’ectoderme du pôle animal n’avait pas la morphologie épithéliale épaissie caractéristique de la plaque animale (Fig. 4, comparer A, B avec C, parenthèses). Dans certains lots d’embryons, la gastrulation s’est déroulée normalement, bien qu’elle ait été retardée, et la position de l’archentéron a montré que la polarité orale/aborale était établie (Fig.4A). Dans d’autres lots, la plupart des embryons se sont exogastriques. Dans les embryons dépourvus de Six3, la différenciation neurale était fortement inhibée, comme l’a montré l’immunomarquage des marqueurs neuraux normalement exprimés pendant les stades lategastrula et pluteus (Fig.4, comparer A,B avec C). La majorité (2/3) des embryons contenaient des neurones nosérotonergiques et les autres en avaient un nombre réduit (Fig. 4D) par rapport au nombre normal à ce stade (3-5). La même chose était vraie pour tous les autres neurones, évalués par le marqueur pan-neural synaptotagmin (1e11) (Fig. 4A,B), qui sont trouvés dans l’APD et la bande ciliée des embryons normaux de 3 jours (Fig. 4C). De façon significative, l’expression de hbn a été réduite à un niveau indétectable par hybridation in situ (Fig. 4F versus Fig. 4E). Les mesures de QPCR ont confirmé cette observation et ont montré que les niveaux des ARNm hbn et foxq2, qui marquent les limites extérieures et les portions intérieures de l’APD, respectivement, ont été réduits de 8 à 10 fois dans les morphants Six3 au stade de la blastula du thèmeenchyme (Fig.5).

Six3 est nécessaire pour l’expression de la plupart des gènes dans l’ensemble E-APD

Le phénotype frappant produit par la perte de Six3, ainsi que son expression précoce dans l’embryon, a suggéré qu’il pourrait fonctionner près du sommet du réseau de régulation des gènesAPD. Pour examiner cette possibilité de manière plus approfondie, nous avons utilisé l’analyse des microréseaux pour rechercher les gènes dépendant de Six3 à 27 heures, le moment où les gènes de l’ensemble E-APD approchent des niveaux d’expression maximum. Afin d’éliminer les fonctions endomésodermiques de Six3, nous avons effectué ce criblage dans des embryons injectés deΔcadhérine. Comme le montre la figure 5A, la perte de Six3 dans ces embryons a complètement éliminé le développement de tous les neurones excédentaires trouvés dans les embryons injectés de Δcadhérine et aucun épithélium épais ne s’est formé, démontrant à nouveau un rôle important de Six3 dans le développement de l’APD. Les données des microréseaux ont permis d’identifier un nombre étonnamment élevé de prédictions génétiques (682) qui étaient fortement régulées à la baisse (au moins 4 fois) dans les embryons doublement injectés avec l’ARNm deΔcadhérine et Six3-MO, par rapport aux embryons injectés avec l’ARNm deΔcadhérine seul. En outre, plus de 60 % de tous les gènes de l’écran de microarray précédent qui ont été régulés à la hausse au moins 3 fois dans les embryons injectés avec l’ARNm deΔcadhérine, et donc susceptibles d’être exprimés dans l’APD, ont été significativement régulés à la baisse par la perte de Six3. Il est important de noter que les données de microréseau ont indiqué que la majorité des gènes E-APD étaient sensibles à Six3 (Fig. 5B, jaune). En bon accord avec cela, les mesures QPCR dans deux autres lots d’embryons ont montré que seulement 5 gènes E-APD ne dépendaient pas significativement de Six3(Fig. 5B, rouge, bleu).

La surexpression de Six3 est suffisante pour étendre l’APD

Ces résultats soutiennent fortement l’idée que Six3 fonctionne tôt dans les réseaux de régulation des gènes de l’APD, et soulèvent la possibilité qu’il pourrait être suffisant pour induire d’autres cellules dans l’embryon à adopter des destins APD.La mésexpression de Six3 a entraîné des embryons affichant un changement extraordinaire dans la morphologie. Une bande en forme de fer à cheval de cellules densément tassées s’est étendue dans la direction végétale à partir du pôle animal (Fig. 6, comparer B, C avec A).Les neurones sérotoninergiques, normalement limités à la plaque animale (Fig. 6D), ont été multipliés par 4 et distribués le long de la bande dense (Fig. 6G). De plus, la forme des colonnes et la disposition des projections neuronales dans les cellules contenant de la synaptotagmine (1e11) sont similaires à celles de la plaque animale des embryons témoins (Fig. 6E, encadré pointillé blanc versus Fig. 6H). Toutes ces cellules contiennent dans leurs noyaux NK2.1 (Fig. 6J-M, vert), un facteur de transcription normalement exprimé dans la plaque animale et l’ectoderme supra-oral adjacent (Fig.6I,I′ ; cercles verts dans la Fig. 6U), ainsi que quelques cellules dans l’intestin antérieur (Takacs et al.,2004). Une chaîne de cellules neurales 1e11-positives divise la bande (Fig. 6K, rouge) et les cellules du côté intérieur de la bande NK2.1-positive expriment également Gsc (Fig. 6L,N, rouge). La combinaison de NK2.1 et de Gsc marque de façon unique l’épithélium facial supra-oral au niveau du bord oral de la plaque animale (Fig.6I,I′, cellules jaunes et Fig. 6U, cercles jaunes). Les cellules colonnaires denses de la bande élargie entourent des cellules épithéliales plus aplaties qui expriment NK2.1, mais pas Gsc (Fig. 6M,N), comme le font les cellules des régions supérieures de la bouche des embryons normaux (Fig. 6I, bouche, m). Une autre preuve que ces cellules sont similaires à celles proches de la bouche des embryons normaux est qu’elles expriment l’ARNm hbn, qui, dans les embryons normaux de 3 jours, s’accumule autour de la marge de la plaque animale et s’étend dans l’ectoderme supra-oral (Fig.1, Fig. 6O). Chez les embryons qui mésexpriment la protéine Six3, les cellules positives pour la protéine hbn sont concentrées dans l’épithélium mince du pôle végétal et sont donc situées dans la même position par rapport à la plaque animale élargie et aux cellules positives pour la protéine Nk2.1- dans l’intestin supérieur que chez les embryons normaux (Fig.6P,Q). Le côté opposé à la région orale se différencie comme un épithélium mince-squameux, exprime le marqueur de l’ectoderme aboral, Spec1 (Fig. 6R-T) et peut correspondre à la bande d’ectoderme aboral hbn-positive adjacente à la plaque animale. Collectivement, ces modèles d’expression génétique mènent à la conclusion remarquable que Six3 est suffisant pour re-spécifier les destins des cellules dans la plupart du reste de l’embryon, générant un embryon de 3 jours composé d’un domaine du pôle animal fortement élargi, mais correctement structuré, avec une polarité orale/aborale. L’APD dans les embryons normaux et Six3-misexprimant est marqué par les cercles bleus dans la Fig. 6U.

Parce que Six3 mal exprimé peut étendre l’ensemble de l’APD et promouvoir le développementde neurones ectopiques, nous avons demandé quels gènes de l’ensemble de gènes E-APD étaientupregulés, en utilisant des mesures de microréseau et de QPCR.Le tableau 2 énumère 10 de ces gènes dont les niveaux d’ARNm sont élevés d’au moins 3 fois dans les embryons à ARNm de Six3.

Six3 peut supprimer la signalisation TGF-β mais n’élimine pas la polarité orale/aborale

La misexpression de Six3 n’élimine pas la polarité orale/aborale parce que les marqueurs de l’ectoderme oral etaboral sont exprimés sur les côtés opposés de l’embryon et les neurones normalement trouvés dans l’APD sont confinés à une bande intermédiaire.Cependant, Six3 mis-exprimé réduit l’expression de nodal ainsi que celle de lefty et chordin, dans les blastules de mésenchyme (Tableau 3, gauche), peut-être parce que Six3 fournit une entrée positive dans l’expression de FoxQ2, qui a été montré pour réprimer l’expression de nodal (Yaguchi et al., 2008), De façon surprenante, Six3 ne supprime pas l’accumulation de l’ARNm de bmp2/4 autant qu’il réduit nodal, bien que l’expression de bmp2/4 nécessite une fonction nodale dans les embryons normaux (Duboc et al., 2004). Ce paradoxe apparent peut résulter de la combinaison d’une inhibition réduite de la signalisation de la BMP2/4 par Chordin et de la diffusion de la BMP2/4 et de son auto-activation ultérieure, comme cela a été démontré dans d’autres systèmes (Biehs et al, 1996;Jones et al., 1992).

Les signaux Wnt canoniques, et non TGF-β, empêchent l’expansion de l’APD dans l’ectoderme latéral

Les signaux qui délimitent l’APD dépendent de la signalisation Wnt canonique, car sonélimination permet à l’APD d’englober presque tout l’embryon(Yaguchi et al., 2006)(Fig. 1). Comme Nodal et BMP dépendent des signaux Wnt canoniques, nous avons éliminé les deux ligands du TGF-β avec un Nodal-MO (Yaguchi et al., 2008) pour vérifier s’ils étaient responsables de la restriction de l’APD dépendante de Wnt. La Fig.7B,F montre que ce n’est pas le cas car les neurones sérotonergiques restent limités à l’APD dans ces embryons. Cependant, lorsque les morphants Nodal reçoivent du Six3 exogène, les neurones sérotoninergiques augmentent considérablement en nombre et apparaissent dans toute la moitié animale de l’embryon (Fig. 7D), comme cela est observé dans les embryons mésexprimant laΔcadhérine (Yaguchi et al., 2006), ce qui annule la signalisation Wnt canonique. Par conséquent, l’expression ectopique de Six3 peut outrepasser les autres signaux, vraisemblablement Wnt, qui limitent ces neurones à l’APD des embryons normaux.

Bien que les neurones sérotoninergiques ne se forment pas dans l’ectoderme latéral chez les Nodalmorphants, certains neurones non sérotoninergiques le font (Fig. 7B). Cela résulte principalement, sinon exclusivement, de la perte de la signalisation BMP2/4, car le même résultat est obtenu dans les embryons injectés de BMP2/4-MO (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.A et R. D. Burke, non publié). Comme le développement de tous les neurones dépend de Six3 dans l’embryon normal, nous avons demandé si les neurones ectopiques des Nodalmorphants dépendent également de Six3 en co-injectant Nodal-MO et Six3-MO. Comme prévu, les neurones sérotoninergiques présents au pôle animal chez les Nodalmorphants ont été perdus chez les doubles morphants (Fig. 7G,H). Ces embryons ne contiennent pas de neurones différenciés non sérotoninergiques avec des processus axonaux, bien que quelques points immunoréactifs 1e11 aient été observés. Ceux-ci pourraient indiquer la présence de neurones incomplètement différenciés ou refléter un biais neural initial des cellules de l’ectoderme qui est normalement annulé par le signal TGF-β.

Six3 peut antagoniser la signalisation Wnt

Les faits que l’APD ne s’étend pas dans les morphants Nodal mais le fait dans les embryons injectés deΔcadherin et que Six3 peut surmonter les effets canoniques dépendants de Wnt dans l’ectoderme latéral soulèvent la possibilité que Six3 réprime la signalisation Wnt. L’un d’entre eux est Wnt8, un signal végétal crucial requis pour le développement normal de l’endoméoderme (Wikramanayake et al., 2004), un résultat qui est cohérent avec le manque de développement végétal dans les embryons Six3-misexpressifs. Collectivement, ces résultats suggèrent que les frontières de l’APD sont déterminées par l’antagonisme Six3/Wnt.

Six3 n’est pas suffisant pour réprimer l’expression de wnt et de nodal dans l’APD

La capacité de Six3 à fortement déréguler (directement ou indirectement) les gènes codant les ligands Wnt, ainsi que nodal, lefty et chordin,soulève la possibilité qu’il empêche normalement l’expression de ces gènes dans l’APD. Pour évaluer cela, nous avons d’abord examiné les effets de Six3 sur l’expression des gènes dans les embryons injectés de Δcadherin afin d’éliminer les effets contradictoires possibles de la fonction de Six3 dans l’endoméoderme. Les données de microarray et de QPCR montrent que, dans les embryons constitués principalement de l’APD, Six3supprime l’expression des gènes Wnt, et nodal, lefty etchordin (Tableau 3;Fig. 8). Cependant, dans les embryons normaux (injectés de glycérol), la répression de ces gènes par Six3 ne peut pas être détectée (tableau 3 ; figure 8), ce qui indique que des mécanismes supplémentaires protègent l’APD de l’expression de Wnt et de TGF-β dans l’embryon normal.

Régulation par Six3 d’autres voies de signalisation

Six3 régule également positivement (directement ou indirectement) les gènes codant des protéines qui fonctionnent dans d’autres voies de signalisation (tableau 3). Il s’agit notamment de elta, le ligand de Notch qui agit sur l’inhibition latérale, un processus crucial dans le développement neural, ainsi que d’autres régulateurs potentiels de la neurogenèse. Ces derniers comprennent fgf9/16/20, semblable à fgfr, un récepteur lié à la membrane dépourvu du domaine tyrosine kinase, et frizzled5/8, un récepteur Wnt qui peut transduire des signaux non canonique, mais dont la fonction dans l’APD est inconnue (Croce etal., 2006). Les études futures examineront comment les activités de ces voies de signalisation et des facteurs de transcription Six3-dépendants précoces interagissent dans le réseau de régulation des gènes de l’APD.

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