Animaux
S. purpuratus ont été maintenus dans de l’eau de mer artificielle à 14 °C. L. anatina ont été collectés en juin 2016 dans les zones humides de Xiangshan, district de Xiangshan, ville de Hsinchu, Taïwan (coordonnées GPS 24.770779, 120.910742 E), transportés au laboratoire sur glace, puis disséqués immédiatement.
Constructions et plasmides
Pour déterminer l’activité enzymatique des SpAIDLs et LaAIDLs, des vecteurs d’expression bactériens respectifs pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID ont été générés pour les SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 et HsAID. Les cadres de lecture ouverts de chaque SpAIDL ont été amplifiés à partir de l’ADN génomique par PCR en utilisant la polymérase Phusion et des amorces contenant les sites de restriction SpeI et XhoI (Tableau supplémentaire 1). Les produits de la PCR ont été digérés avec SpeI et XhoI (New England Biolabs) et insérés dans les sites NheI/XhoI de pASK-TadA (don du Dr Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York) en remplacement du cadre de lecture ouvert TadA. Pour SpAIDL9, cette stratégie de clonage a changé le troisième acide aminé de la phénylalanine à la sérine, et cette mutation F3S a été ramenée à F3 en utilisant le kit de mutagenèse Quikchange (Stratagene) avec les amorces SPA9S3FT/SPA9S3FB (tableau supplémentaire 1). HsAID a été amplifié à partir d’un plasmide contenant la longueur complète de l’AID humain (pCDF-AID, un don du Dr Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York). La stratégie de clonage a changé le deuxième acide aminé de l’aspartate à l’alanine, et D2A a été retourné à D2 en utilisant le kit de mutagenèse Quikchange (Stratagene) avec les amorces hAIDA2DT/hAIDA2DB (tableau supplémentaire 1). Le pASK vide a été généré par la digestion NheI/XhoI de pASK-TadA, le remplissage des surplombs en utilisant la polymérase Klenow, et la ligature avec l’ADN ligase T4 (Thermo Scientific). Les cadres de lecture ouverts de chaque LaAIDL ont été amplifiés à partir de l’ADNc de L. anatina et clonés dans le vecteur de clonage pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Les cadres de lecture ouverts LaAIDLX ont été excisés avec SpeI et XhoI (New England Biolabs), et clonés dans les sites XbaI/XhoI de pASK_V5-SpAID4a (décrit ci-dessous), remplaçant l’insert SpAID4a. Il convient de noter que les fragments clonés contiennent les codons stop d’origine à leurs extrémités 3′, de sorte que la protéine exprimée ne contient pas de balise V5.
Les constructions d’expression pour les mutants du site actif de SpAIDL1 et LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, et LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) ont été générés par mutagenèse dirigée à partir des plasmides de type sauvage (ou mutant unique) respectifs en utilisant soit le kit de mutagenèse Quikchange (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB pour SpAIDL1 RQ), soit par PCR conventionnelle en utilisant des amorces 5′-phosphorylées (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB pour le deuxième ensemble d’altérations de SpAIDL1 RQAA, et LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P et LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P pour SpLaAIDL1 RQRQ), suivies d’une digestion par DpnI, d’une ligature pour circulariser les produits, et d’une transformation en E. coli.
Pour surveiller le niveau d’expression de la protéine recombinante dans E. coli, les constructions d’expression bactérienne pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID ont été créées. pASK_V5 a été généré par l’hybridation des oligonucléotides pASK_V5F/pASK_V5R (Tableau supplémentaire 1) contenant la séquence de marquage V5, et leur ligature dans les sites NheI/SalI de pASK-TadA. Les plasmides pASK-SpAIDLX/LaAIDLX ont été utilisés comme modèles pour amplifier les ADNc respectifs sans codon stop, en utilisant la polymérase Phusion et les amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1, et clonés dans les sites NheI/XhoI (pour les fragments SpAIDLX et HsAID) ou XbaI/XhoI (pour les fragments LaAIDLX) de pASK_V5. HsAID a été amplifié à partir de pASK-hAID. Les séquences des deux, SpAIDL9 et HsAID, ont été de nouveau modifiées par cette stratégie de clonage, et ont été modifiées de nouveau aux séquences correctes comme décrit ci-dessus.
Préparation de l’ADN génomique
Les ADN génomiques des deux, S. purpuratus et L. anatina, ont été purifiés en utilisant le gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) en suivant les instructions du fabricant. En bref, environ 1 × 106 coelomocytes de S. purpuratus et 100 mg de tissu de L. anatina ont été ajoutés dans des tubes de microcentrifugation séparés, homogénéisés dans 200 µl de tampon GT (Bioman) contenant 200 mg de protéinase K, et incubés pendant 30 min à 60 °C pour lyser complètement les cellules. Après l’ajout de 200 µl de tampon BG (Bioman), les échantillons ont été agités au vortex et incubés pendant 20 min à 70 °C. Ensuite, 200 µl d’éthanol ont été ajoutés et l’échantillon entier a été chargé sur une colonne de spin GD (Bioman). Des lavages avec 400 µl de tampon WI (Bioman) et 600 µl de tampon de lavage ont été effectués par centrifugation à 10 000×g pendant 30 s. Ceci a été suivi par l’élution des ADN génomiques avec 100 µl de tampon d’élution (10 mM Tris pH = 8,0) qui a été préchauffé à 60 °C.
Préparation des ARN et synthèse des ADNc
Le fluide coelomique de S. purpuratus a été aspiré à l’aide d’une seringue à travers la membrane périostomale et mélangé immédiatement avec un volume égal de CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazole). Les cœlomocytes ont été essorés et remis en suspension dans 800 μl de réactif d’ARN total EasyPure (Bioman). L’œsophage, l’intestin grêle, le gros intestin et les gonades de S. purpuratus et le pédicule, le cæcum digestif, la gonade et l’intestin de L. anatina ont été disséqués sur des animaux individuels. De petits morceaux de tissus solides de S. purpuratus et de L. anatina ont été ajoutés à 200 μl de réactif EasyPure Total RNA (Bioman), et les échantillons ont été homogénéisés dans un Bullet Blender (Next Advance) en utilisant des billes de ZrO de 0,5 mm. Les débris insolubles ont été essorés et les surnageants ont été transférés dans des tubes frais contenant 600 μl de réactif EasyPure Total RNA (Bioman) et 200 μg de glycogène comme support. L’ARN total a ensuite été purifié selon le protocole du fabricant. Pour éliminer l’ADNg résiduel et les autres contaminants, les ARN de S. purpuratus ont ensuite été traités à l’aide du kit Turbo DNA-free (Ambion) ou du kit RNeasy mini (Qiagen). Le kit Turbo DNA-free (Ambion) a été utilisé conformément au protocole du fabricant, à l’exception de l’ajout de MgCl2 (2,5 mM) et de CaCl2 (1 mM) pour la digestion par la DNase. Le mini kit RNeasy (Qiagen) a été utilisé selon le protocole du fabricant.
Environ 250-500 ng d’ARN de S. purpuratus et de L. anatina de chaque tissu ont été convertis en ADNc en utilisant le système ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) ou le kit ToolsQuant II Fast RT (Biotools), respectivement. Dans les deux cas, des hexamères aléatoires ont été utilisés et les instructions du fabricant ont été suivies.
Amplification rapide des extrémités de l’ADNc
Les extrémités 5′ et 3′ des transcrits de SpAIDL9 ont été amplifiées à l’aide du kit SMARTer RACE (Clontech) et des amorces spécifiques du gène SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (voir tableau supplémentaire 2) selon les instructions du fabricant. Les produits PCR contenant les extrémités 5′ et 3′ des transcrits ont été clonés dans le vecteur de clonage pJET1.2/blunt (Thermo Scientific), et les clones individuels ont été entièrement séquencés.
Analyse de séquence des gènes SpAIDL
L’ADN génomique de trois individus S. purpuratus individus (Sp105, Sp111, Sp112) ont été utilisés comme modèles pour amplifier les cadres ouverts de lecture de SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 en utilisant la polymérase Phusion et les amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 2. Les produits PCR ont été clonés dans le vecteur de clonage pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Les plasmides ont été purifiés à l’aide du kit Tools mini plasmid (Biotools) et soumis à un service commercial (Genomics Taiwan) pour le séquençage en utilisant les amorces pJET1.2 forward ou pJET1.2 reverse.
Au moins huit séquences ont été recueillies pour chaque gène de chaque oursin, et les séquences d’amorces ont été exclues pour avant les alignements de séquences. Les séquences nucléotidiques de chaque gène ont d’abord été alignées au sein de chaque S. purpuratus en utilisant CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw), et les séquences dominantes correspondant aux deux allèles ont ensuite été sélectionnées pour une comparaison ultérieure entre les oursins individuels.
Analyse de l’expression génique
L’ADN complémentaire de trois individus S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) et de deux individus L. anatina (La1 et La3) a été utilisé comme matrice pour tester l’expression soit de SpAIDL1, 2, 3, 4a et 9, soit de LaAIDL1 et 2 par PCR quantitative. Chaque réaction qPCR (10 μl) contenait 5 μl de mélange maître Fast SYBR Green (Applied Biosystems), des amorces (0,1 μM) (voir le tableau supplémentaire 3) et 1 μl de matrice, et pour chaque échantillon, deux répliques techniques ont été configurées. Les réactions qPCR ont été réalisées dans un système PCR 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems), en appliquant une étape de dénaturation initiale à 95 °C pendant 20 s, suivie de 40 cycles de 3 s à 95 °C et 30 s à 60 °C. Des courbes standard ont été utilisées pour déterminer les niveaux d’expression des gènes et des gènes domestiques (Sp18S pour S. purpuratus et LaRPL39 pour L. anatina) ont été utilisés pour la normalisation.
Modèle d’infection bactérienne
Vibrio diazotrophicus ont été cultivés dans des cultures liquides de bouillon marin Difco (Becton Dickinson) à 30 °C et 250 rpm pendant la nuit. Six oursins sains ont été choisis au hasard et divisés en deux groupes, un groupe expérimental et un groupe témoin. Des aliquotes de fluide coelomique (0,5 ml) ont été prélevées sur chaque animal à t = 0. Les oursins du groupe expérimental ont été injectés avec une suspension de Vibrio diazotrophicus vivant dans 200 µl d’eau de mer artificielle stérile, la quantité de bactéries étant ajustée pour chaque oursin afin de correspondre à 106 cellules/ml du volume total de fluide coelomique. Le groupe témoin a été injecté avec 200 µl d’eau de mer stérile. A t = 6, 24 et 48 h, 200 µl de liquide coelomique ont été prélevés sur chaque animal de chaque groupe. L’ARN a été extrait des coelomocytes obtenus à chaque point de temps, et de l’ADN génomique a également été préparé à partir des échantillons de t = 0. Les paires d’amorces pour l’analyse de l’expression des gènes (Tableau supplémentaire 3) ont d’abord été testées sur les échantillons d’ADN génomique pour s’assurer qu’elles peuvent amplifier le gène respectif de chaque individu, malgré les niveaux notables de polymorphisme dans leur séquence au sein de la population de S. purpuratus (voir Fig. 1b). La RT-PCR quantitative (comme décrit ci-dessus) a été utilisée pour mesurer les niveaux d’expression des gènes avec au moins deux répliques techniques par échantillon. Les valeurs d’expression ont d’abord été normalisées aux niveaux de 18S dans chaque échantillon, puis aux valeurs à t = 0 pour chaque animal. Trois réplicats biologiques ont été utilisés pour le groupe expérimental et le groupe témoin, et tous les points de données sont présentés.
Tests CDA avec rapporteur de résistance à la kanamycine
Un protocole optimisé d’un test largement utilisé pour mesurer les activités CDA polynucléotidiques26 a été utilisé. Le plasmide rapporteur pTAC-Kan déaminase contenant une mutation ponctuelle L94P dans le gène KanR et les vecteurs d’expression individuels pASK-SpAIDLX/LaAIDLX ont été transformés séquentiellement dans la souche BH156 E. coli déficiente en UNG. Le vecteur d’expression de l’AID humain pASK-HsAID et le vecteur vide pASK ont servi de témoins positifs et négatifs, respectivement. Pour le dosage de la désaminase, au moins huit colonies individuelles pour chaque désaminase putative ont été cultivées dans un bouillon LB (contenant 50 μg/ml d’ampicilline (Amp), 50 μg/ml de spectinomycine (Spc) et 17 μg/ml de chloramphénicol (Cam)) jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,3. Chaque culture a ensuite été divisée en deux. Alors que l’IPTG (1 mM) a été ajouté aux deux, l’anhydrotétracycline (AHT) (0,2 μg/ml) a été ajoutée uniquement à l’une d’entre elles pour induire l’expression de SpAIDLX/LaAIDLX. Après une incubation de 3 h à 37 °C et 200 rpm, les cultures ont été essorées, lavées avec du PBS et étalées sur des plaques LB contenant soit 50 μg/ml d’Amp, 50 μg/ml de Spc et 17 μg/ml de Cam, soit 50 μg/ml d’Amp, 50 μg/ml de Spc, 17 μg/ml de Cam et 30 μg/ml de kanamycine (Kan). Les fréquences de réversion ont été calculées comme les rapports entre le nombre de colonies KanR et le nombre total de colonies sur la plaque Amp+Spc+Cam. La fréquence de réversion relative a ensuite été déterminée comme le rapport des fréquences de réversion d’une paire de cultures bactériennes identiques, dans lesquelles la transcription de KanR a été induite avec de l’IPTG en présence ou en l’absence d’expression de la désaminase. Pour confirmer que les colonies KanR résultaient réellement de la désamination de l’ADN, les plasmides pTAC-Kan de plusieurs colonies ont été purifiés et la réversion du codon stop confirmée par séquençage de l’ADN.
Tests CDA utilisant rpoB comme rapporteur
Un protocole optimisé d’un test largement utilisé pour mesurer les activités CDA des polynucléotides35 a été utilisé. Les vecteurs d’expression pASK individuels des désaminases d’invertébrés ont été transformés séparément en BH156 E. coli déficient en UDG. Des cultures de 4 ml de milieu LB contenant 100 µg/ml d’Amp, 17 µg/ml de Cam et 0,3 µg/ml d’AHT ont été inoculées avec des colonies bactériennes uniques. Les cultures ont été cultivées pendant 24 h à 37 °C 230 rpm, des aliquotes ont été placées sur des plaques de gélose LB contenant 100 µg/ml d’Amp ou 100 µg/ml de rifampicine, et cultivées à 37 °C pendant la nuit. Les colonies ont été comptées et les fréquences de réversion ont été calculées comme le rapport entre le nombre de colonies RifR et le nombre de colonies AmpR de la même culture. Les cultures exprimant HsAID ou contenant le vecteur d’expression pASK vide ont servi de témoins positifs et négatifs, respectivement. Au moins huit cultures par construction d’expression ont été testées. Pour déterminer l’identité des mutations dans le gène rpoB des colonies résistantes à la rifampicine, des PCR de colonies ont été effectuées à partir de 24 colonies individuelles en utilisant la polymérase Phusion et la paire d’amorces rpoBF/rpoBR. Les produits PCR ont été purifiés sur gel et soumis à un séquençage à l’aide de l’amorce rpoBF. Les mutations ont été identifiées par comparaison avec la séquence WT (acc. Genbank CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Expression protéique des désaminases d’invertébrés dans E. coli
Pour surveiller le niveau d’expression de SpAIDLX/LaAIDLX dans les essais de désaminase, pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX ont été transformés dans BH156 déficient en UNG. Les colonies individuelles ont été cultivées dans un bouillon LB (contenant 50 μg/ml d’Amp, 50 μg/ml de Spc et 17 μg/ml de Cam) jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm soit de 0,3. De l’IPTG (1 mM) et de l’AHT 0,2 (μg/ml) ont été ajoutés à la culture pour induire l’expression des protéines. Après une incubation de 3 h (37 °C, 200 rpm), les cultures ont été culottées et lavées avec du PBS. Les culots ont été lysés dans un tampon d’échantillon SDS 2x, dilués dix fois, et séparés sur une paire de gels SDS-PAGE à 10%. Tandis qu’un gel a été coloré avec du bleu de Coomassie pour évaluer si des quantités égales de protéines étaient chargées, l’autre gel a été transféré sur des membranes PVDF par transfert semi-sec et les désaminases marquées V5 ont été détectées en utilisant un anticorps primaire anti-V5 de souris (Abcam, ab27671) et un antisérum secondaire lapin-anti-souris couplé à la peroxydase de raifort (Jackson ImmunoReasearch). Les signaux chimiluminescents ont été visualisés à l’aide du substrat chimiluminescent Immobilon Western HRP (Millipore) et d’un film radiographique ou d’un système d’imagerie ChemiDoc Touch (BioRad). Des images non recadrées de tous les gels de protéines colorés et des western blots sont présentées dans la figure supplémentaire 5. Toutes les expériences d’expression bactérienne ont été réalisées en double.
Bioinformatique
Les comparaisons de séquences avec le génome de l’oursin ont été effectuées à l’aide de BLAST, BLASTP ou BLASTN sur https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou www.echinobase.org en utilisant soit les paramètres standard, soit le filtre de faible complexité désactivé. Les alignements de séquences multiples ont été réalisés à l’aide de CLUSTALW et optimisés manuellement sur la base des caractéristiques de structure secondaire prédites. Des analyses phylogénétiques et d’évolution moléculaire ont été réalisées à l’aide de MEGA (version 7)36.
Disponibilité des données
Les données de séquence qui soutiennent les résultats de cette étude ont été déposées dans Genbank avec les codes d’accession suivants : SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).