Les monocytes/macrophages CD11c+ favorisent l’inflammation intestinale chronique induite par Helicobacter hepaticus par la production d’IL-23

H. hepaticus modifie le compartiment des phagocytes mononucléaires intestinaux

La bactérie Gram-négative Helicobacter hepaticus (Hh) est un organisme non invasif que l’on trouve couramment dans la couche muqueuse du tractus intestinal inférieur murin. Les animaux de type sauvage infectés par la bactérie ne développent pas d’immunopathologie intestinale et servent de porteurs de l’infection.21 Cependant, les souris présentant des déficiences génétiques dans la voie IL-10/IL-10R sont sensibles à l’infection expérimentale par Hh et développent une inflammation sévère du côlon et du cæcum (typhlocolite) associée à une hyperplasie épithéliale22, De même, l’infection par Hh de souris de type sauvage avec l’administration concomitante d’anticorps monoclonaux (AcM) anti-IL-10R déclenche une inflammation intestinale dépendante de l’IL-23 ainsi qu’une réponse robuste des cellules T effectrices polarisées de type 1/type 17 (Th1/Th17).23 Les souris infectées par Hh et traitées par des anticorps anti-IL-10R, mais pas les témoins non infectés ou traités individuellement, développent des caractéristiques histologiques de colite dans les 2 à 3 semaines suivant l’infection (Figure 1a). Les souris traitées par Hh et par des anticorps anti-IL-10R présentent en outre une infiltration marquée de leucocytes dans la lamina propria (Figure 1b), y compris des populations prédominantes de neutrophiles et de monocytes MHCII+ (Figure 1c et Figure supplémentaire S1a en ligne). Dans le côlon non enflammé, les monocytes qui pénètrent dans la lamina propria à partir du sang donnent de préférence naissance à des macrophages tissulaires11 (définis comme des cellules Ly6Clo CD11b+ CX3CR1hi, sous-ensemble vert), exprimant des niveaux élevés de CD64, MHCII, F4/80 et CD11c (Figure 1d et Figure supplémentaire S1b). Cependant, ce processus est considérablement modifié pendant l’inflammation et nous avons observé l’accumulation marquée de monocytes MHCII+ (définis comme des cellules CX3CR1int Ly6Chi CD11b+, sous-ensemble rouge) dans la lamina propria colique. Ces cellules sont caractérisées par l’expression de CD64 et MHCII et par des niveaux intermédiaires de F4/80, CD24 et CD11c (Figure 1c-e et Figure supplémentaire S1a). À l’état d’équilibre, les monocytes et les macrophages MHCII+ expriment le récepteur du mannose (CD206), un marqueur associé à la fonction anti-inflammatoire des macrophages.24 Cependant, l’expression de CD206 était plus faible dans les monocytes et les macrophages MHCII+ au cours de la colite (Figure 1f), ce qui suggère que non seulement les fonctions des monocytes mais aussi celles des macrophages sont modifiées au cours de l’inflammation. En effet, nous avons constaté que pendant l’inflammation, les monocytes MHCII+ exprimaient des quantités plus élevées de protéines de facteur de nécrose tumorale-α et IL-6, ainsi que l’ARNm Nos2 (synthase d’oxyde nitrique inductible), et que l’IL-6 était également augmenté dans les macrophages (Figure supplémentaire S1c). La production d’IL-10 par les monocytes MHCII+ et les macrophages était également augmentée pendant l’inflammation (figure supplémentaire S1c), reflétant très probablement une voie de rétroaction négative induite par l’inflammation.

En plus de leur différenciation en macrophages, il a également été démontré que les monocytes MHCII+ se différencient en un sous-ensemble hétérogène Ly6Clo CX3CR1int apparenté à la fois aux macrophages et aux DCs classiques.11 Parmi ce compartiment hétérogène, les DC CD11b+ (définies comme des cellules CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int, sous-ensemble gris) peuvent facilement être distinguées des macrophages dans des conditions homéostatiques. Les CD CD11b+ expriment MHCII, CD24 et CD11c, mais n’expriment pas CD64 et F4/80, marqueurs communément associés aux macrophages (figure 1d et figure supplémentaire S1b). Cependant, la distinction entre les macrophages et les DC CD11b+ a été brouillée au cours de l’inflammation par l’apparition d’une population exprimant CD64 (Figure 1d,e) et il n’est actuellement pas clair comment ces cellules se rapportent ontogéniquement et fonctionnellement aux macrophages ou aux DC CD11b+ à l’état stable.

Dans l’ensemble, l’infection à Hh en présence d’un blocage de l’IL-10R déclenche une inflammation intestinale associée à des changements spectaculaires dans le compartiment myéloïde. Nous avons observé l’accumulation prédominante de granulocytes et de monocytes MHCII+ au sein de la lamina propria colique. De plus, les monocytes MHCII+ et les macrophages ont acquis un profil plus pro-inflammatoire.

Les phagocytes mononucléaires CD11c+ conduisent la colite par la production d’IL-23

Parce que l’IL-23 a été identifié comme le principal moteur de la colite dans ce modèle,23 nous avons ensuite étudié la pertinence fonctionnelle de la production d’IL-23 par les phagocytes mononucléaires dans le développement de la colite dans le modèle Hh+anti-IL-10R. Nous avons donc croisé des souris exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) et la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur CD11c (codé par Itgax)25, 26 avec des souris possédant deux sites loxP flanquant quatre exons du gène Il23a27 pour générer des souris Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-).

Comme les souris CD11cIL-23- expriment la GFP sous le contrôle du promoteur CD11c et ne peuvent donc pas être croisées avec des souris rapporteuses CX3CR1-GFP, nous nous sommes appuyés sur une stratégie de sélection alternative pour évaluer le compartiment myéloïde chez ces souris (figure supplémentaire S2). À l’état d’équilibre, les souris CD11cIL-23- présentaient un nombre de leucocytes dans le côlon similaire à celui de leurs congénères déficientes en IL-23 (CD11cIL-23+) (Figure supplémentaire S3a) et aucun changement significatif dans les fréquences des cellules myéloïdes ou T n’a été observé (Figure supplémentaire S3b). Cependant, comme l’IL-23 est nécessaire au maintien des cellules Th17 différenciées28, les souris CD11cIL-23- ont présenté des niveaux fortement réduits de cellules T CD4+ IL-17+ et IL-17+ IFNγ+ dans le côlon (figure supplémentaire S3c).

Après infection par Hh et traitement anti-IL-10R, les souris CD11cIL-23- ont présenté une réduction frappante de la colite par rapport aux souris CD11cIL-23+, avec une hyperplasie réduite de la crypte épithéliale et une infiltration leucocytaire plus faible dans tout le côlon et le cæcum (Figure 2a,b). Les souris CD11cIL-23- n’ont pas non plus montré de développement de splénomégalie (Figure 2c), indiquant qu’elles étaient également protégées des signes systémiques de la maladie. La réduction de la pathologie observée chez les souris CD11cIL-23- n’était pas une conséquence d’une charge bactérienne différentielle, car les niveaux de colonisation Hh étaient similaires dans les groupes CD11cIL-23- et CD11cIL-23+ (Figure 2d). Conformément à la réduction des changements pathologiques, les cytokines effectrices innées et adaptatives étaient fortement réduites dans le côlon des souris CD11cIL-23- après le blocage de Hh et de IL-10R (Figure 2e), tout comme la quantité d’IL-23 elle-même (Figure 2f).

Conformément à leur infiltration leucocytaire réduite, les souris CD11cIL-23- ont montré une fréquence et un nombre réduits de monocytes MHCII- et MHCII+ (figure 3a) et de neutrophiles (figure supplémentaire S3d) au sein de la lamina propria après une infection par Hh et un blocage de l’IL-10R, par rapport à leurs congénères CD11cIL-23+ traités de manière similaire. L’infiltration plus faible de monocytes chez les souris CD11cIL-23- était corrélée à une fréquence plus élevée de macrophages de la lamina propria, tandis que les fréquences des DC CD11b+ et des DC CD103+ étaient inchangées et que les nombres absolus étaient réduits (figure supplémentaire S3d).

Parce que l’IL-23 conduit l’inflammation intestinale par des effets directs sur les cellules T, favorisant leur accumulation et leur prolifération dans le côlon,29 nous avons examiné le compartiment des cellules T coliques des souris CD11cIL-23- et CD11cIL-23+ pendant la colite. Les souris CD11cIL-23- présentaient des fréquences plus faibles de cellules T CD4+ coliques par rapport à leurs compagnons de portée déficients en IL-23 (Figure 3b). Alors que les souris CD11cIL-23+ ont monté une réponse effectrice Th1/Th17 robuste caractérisée par l’émergence de cellules T à production simple et double IL-17A+/IFNγ+, les souris CD11cIL-23- n’ont montré qu’une induction légère des cytokines correspondantes (Figure 3c).

Dans l’ensemble, l’absence de colite chez les souris CD11cIL-23- indique que la production d’IL-23 par les MNP exprimant CD11c joue un rôle non redondant dans la réponse inflammatoire intestinale.

Les monocytes et les macrophages MHCII+ sont la principale source d’IL-23 lors de l’infection par H. hepaticus

Pour mieux comprendre la séquence des événements associés au développement de la colite chez les souris déficientes en IL-23, nous avons d’abord suivi l’expression de l’IL-23 dans les leucocytes purifiés de la lamina propria colique. L’expression de l’ARNm de l’IL-23 était détectable 4 à 5 jours après le début de la colite (Figure 4a), ce qui suggère qu’un sous-ensemble cellulaire résidant dans le tissu et/ou rapidement mobilisé est impliqué dans la production précoce d’IL-23 dans le côlon. Nous avons donc choisi ce point temporel pour les analyses suivantes. 4 jours après l’infection par Hh et le traitement anti-IL-10R, les souris CD11cIL-23+ ont montré une infiltration accrue de leucocytes dans la lamina propria par rapport aux souris témoins non infectées (Figure 4b). Cet afflux était corrélé à une augmentation du nombre de tous les sous-ensembles de MNP dans le côlon (figure supplémentaire S4a,b), ainsi qu’à une augmentation de la fréquence des monocytes MHCII- et MHCII+ (figure 4c,d), des neutrophiles (figure 4d), des DC CD103+ CD11b- et des DC CD103+ CD11b+ (figure 4e). Cependant, les fréquences des macrophages et des CD CD11b+ parmi les leucocytes totaux sont restées inchangées à ce moment-là (figure 4d).

Pour caractériser davantage les sous-ensembles myéloïdes impliqués dans l’inflammation intestinale dépendante de l’IL-23, nous avons examiné l’expression de la GFP associée à CD11c-Cre par les cellules de la lamina propria des souris CD11cIL-23+. L’analyse des cellules CD45+ a confirmé que l’expression de la GFP associée à Cre était restreinte aux leucocytes exprimant CD11c sur leur surface cellulaire (Figure 4f), mais était principalement observée dans les cellules CD11chi. De plus, la fluorescence GFP associée à la Cre n’a été observée que dans les cellules MHCII+ (Figure 4g) et, fait intéressant, l’expression de l’ARNm Il23a était limitée aux cellules Cre-GFP+ (Figure 4h). La majorité des MNP de la lamina propria expriment des niveaux élevés de CD11c (figure 1e et figure supplémentaire S1b). L’analyse des sous-ensembles myéloïdes distincts chez les souris CD11cIL-23+ a révélé que l’expression de la GFP associée à CD11c-Cre était principalement détectée parmi les macrophages, les DC CD103+ CD11b-, les DC CD103+ CD11b+, (Figure 4i), et les DC CD11b+ (non montré). En outre, plus de la moitié des monocytes MHCII+ étaient positifs pour la Cre-GFP, ce qui indique que tous ces sous-ensembles pourraient être une source potentielle d’IL-23. En revanche, l’expression de Cre était absente des éosinophiles, des neutrophiles et des monocytes MHCII- (Figure 4i).

Pour caractériser lequel de ces sous-ensembles représente une source fonctionnelle d’IL-23 in vivo, nous avons évalué l’expression de l’ARNm Il23a par les populations correspondantes triées par cytométrie de flux à partir de souris CD11cIL-23- et CD11cIL-23+ 4 jours après l’infection par Hh en présence d’un blocage de IL-10R. Il est frappant de constater que l’expression de l’ARNm de Il23a dans les cellules CD11cIL-23+ était principalement limitée aux monocytes et macrophages MHCII+, avec une faible expression détectable parmi les DC CD103+ CD11b- et les DC CD103+ CD11b+ (Figure 4j). En outre, l’expression de Il23a par les monocytes MHCII+ et les macrophages était nettement réduite chez les souris CD11cIL-23-, ce qui indique que l’expression de CD11c-Cre était active dans ces sous-ensembles cellulaires (Figure 4j). La faible expression de Il23a observée dans les monocytes MHCII- (Figure 4k) suggère que l’induction de IL-23 se produit dans la lamina propria pendant leur maturation locale et l’acquisition du MHCII.

Comme le niveau d’expression de CX3CR1 identifie des sous-ensembles discrets de MNP, nous avons répété notre analyse chez les souris CX3CR1GFP/+. Chez les souris non infectées, de faibles niveaux d’Il23a constitutif ont été détectés parmi les monocytes MHCII+, les DC CD103+ CD11b+, (figure supplémentaire S4c,d), et les DC CD11b+ (figure supplémentaire S4d). Cependant, l’augmentation de l’expression de Il23a 4 jours après l’infection par Hh et le blocage de IL-10R n’a été détectée de manière cohérente que dans les monocytes MHCII+ (figure supplémentaire S4d) et les macrophages (non montré). Au cours de l’inflammation, l’expression élevée de Il23a a été maintenue dans les monocytes MHCII+ et leur progéniture en développement, mais pas dans les DC CD103+ (Figure 5a). Parmi les sous-ensembles CX3CR1int, l’expression de Il23a était en outre limitée aux cellules CD64+ (Figure 5b).

Ensemble, nos données indiquent que l’induction de l’IL-23 dans la colite est contenue dans les cellules CD11c+ exprimant CX3CR1 qui expriment également MHCII et CD64.

Les DC CD103+ dépendantes de Batf3 sont dispensables pour la colite chronique

Les DC CD103+ CD11b+ sont principalement présentes dans l’intestin grêle de la souris et sont presque absentes du côlon6. Au contraire, la plupart des DC CD103+ coliques sont CD11b- et nécessitent le facteur de transcription Batf3 pour leur développement.30 Les souris Batf3-/- sont donc dépourvues de sous-ensembles de DC non lymphoïdes CD8α+ et CD103+ CD11b- résidant dans les tissus. Comme prévu, les cellules CD103+ CD11b- étaient fortement réduites dans la lamina propria colique des souris Batf3-/-, alors que les CD CD103+ CD11b+ n’étaient pas affectées (Figure 6a,b). Pour évaluer si les DC CD103+ CD11b- pouvaient être impliquées dans le développement de la colite, nous avons infecté les souris Batf3-/- avec Hh combiné à un traitement anti-IL-10R. Deux semaines après l’initiation de la colite, le nombre de DC CD103+ CD11b- était encore significativement réduit dans la lamina propria (Figure 6b), mais aucune différence dans l’infiltration leucocytaire (Figure 6c) ou la sévérité de la colite (Figure 6d) n’a été observée chez les souris Batf3-/- par rapport à leurs homologues de type sauvage, ce qui indique que les DC dépendantes de Batf3 sont dispensées de l’induction de l’inflammation intestinale induite par l’IL-23 dans ce modèle.

Les macrophages matures produisent de l’IL-23 en réponse à la stimulation de H. hepaticus in vitro, mais partagent une redondance fonctionnelle avec les monocytes MHCII+ in vivo

Pour déchiffrer la contribution des macrophages à la production d’IL-23, nous avons généré des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) à partir de souris CD11cIL-23- et CD11cIL-23+. Après différenciation avec un milieu conditionné par des cellules L929, environ la moitié des BMDM étaient positifs pour la Cre-GFP et exprimaient CD64, F4/80 et CD11c (figure supplémentaire S5a). Les BMDM ont été stimulées in vitro avec des bactéries Hh vivantes en présence de l’anticorps anti-IL-10R et leur réponse a été comparée aux contrôles respectifs. Il est frappant de constater que la stimulation des BMDM CD11cIL-23+ avec Hh a entraîné l’expression de l’ARNm Il23a et que cette réponse a été renforcée en présence d’un blocage de la signalisation IL-10R, alors qu’Il23a n’a pas été exprimé par les BMDM non stimulés ou ceux traités avec l’anticorps anti-IL-10R seul (figure supplémentaire S5b). De même, l’infection des souris par Hh n’a induit qu’une faible salve d’IL-23 dans les monocytes et les macrophages in vivo et cette réponse a été fortement augmentée en l’absence de signalisation IL-10R (figure supplémentaire S5c).

Les macrophages des tissus intestinaux dérivent exclusivement des monocytes sanguins et ne s’auto-renouvellent pas8, 10 La signalisation du récepteur du facteur 1 de stimulation des colonies (CSF-1R) contrôle la différenciation des Ly6Chi en monocytes Ly6Clo31 et est nécessaire à la maturation et au remplacement des monocytes Ly6Clo de type résident et des macrophages tissulaires, mais elle est inutile pour la production de monocytes Ly6Chi ou la fonction inflammatoire32. Pour évaluer les contributions relatives des monocytes MHCII+ et des macrophages tissulaires au développement de l’inflammation intestinale dépendante de l’IL-23, nous avons prétraité des souris CX3CR1GFP/+ avec un AcM bloquant l’anti-CSF-1R ou un contrôle isotype avant l’induction de la colite. Un groupe de souris a été analysé au jour 0 (figure supplémentaire S6a,b), tandis que les autres souris ont été traitées par Hh et anti-IL-10R et ont continué à recevoir le traitement anti-CSF-1R. Quatre jours après l’infection par Hh et le traitement anti-IL-10R, les macrophages étaient presque absents du côlon des souris traitées par anti-CSF-1R. Le compartiment hétérogène de macrophages/DC Ly6Clo CX3CR1int était également significativement réduit chez ces souris (Figure 7a,b et Figure supplémentaire S6c). Bien que le nombre total de leucocytes coliques soit resté inchangé (figure 7c), on a observé une augmentation de la proportion de granulocytes dans ces conditions (figure 7d). Il est intéressant de noter que la déplétion des macrophages a été corrélée à une augmentation de l’expression de Il23a dans la lamina propria au jour 4 (Figure 7e). Cependant, la déplétion des macrophages médiée par l’anti-CSF-1R tout au long de la colite n’a pas affecté le nombre de cellules inflammatoires s’accumulant dans le côlon (Figure 7f) ou la gravité de la pathologie intestinale (Figure 7g) 2 semaines après l’infection par Hh et le blocage de la signalisation IL-10R, ce qui suggère que les monocytes MHCII+ et les macrophages peuvent présenter une redondance fonctionnelle pendant l’inflammation.

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