Approches non-organoïdes
À ce jour, les lignées cellulaires épithéliales intestinales ont été les principaux systèmes modèles in vitro pour évaluer les processus de transport intestinal, tandis que les lignées cellulaires entéroendocrines sont des modèles courants pour étudier la sécrétion de différentes hormones intestinales. Un modèle établi pour les entérocytes de l’intestin grêle est la lignée cellulaire CaCo-2 (ou le sous-clone CaCo-2 TC7), dérivée d’un adénocarcinome du côlon. Cette lignée cellulaire est couramment cultivée sur des plaques transwell jusqu’à 3 ou 4 semaines post-confluence pour des études sur le transport intestinal de nutriments, de médicaments ou d’autres composés à l’aide de substrats radio-marqués ou marqués par fluorescence (Farrell et al., 2013 ; Ganapathy et al., 1995 ; Wang et Li, 2017). Les cellules HT-29 (et sous-clones) sont une lignée cellulaire de carcinome du côlon humain bien établie pour la recherche sur les transporteurs intestinaux, en particulier les transporteurs de sucre (Delezay et al., 1995 ; Liu et al., 2016). Afin d’étudier le rôle des transporteurs dans la détection des nutriments intestinaux, d’autres lignées cellulaires sont toutefois nécessaires. Les lignées cellulaires entéroendocrines les plus importantes utilisées pour les études sur la sécrétion des hormones intestinales sont la lignée cellulaire murine GLUTag (Emery et al., 2015), la lignée cellulaire murine STC-1 (Jiang et al., 2016) et la lignée cellulaire humaine NCI-H716 (Pais et al., 2014). Aucune d’entre elles, cependant, ne reflète la biologie complexe des cellules entéroendocrines in vivo (Kuhre et al., 2016). Les cellules entéroendocrines sont réparties dans l’ensemble de l’intestin grêle et du gros intestin, et leurs profils d’expression des différentes hormones intestinales diffèrent fortement, selon leur emplacement dans le tractus intestinal (Habib et al., 2012). Par exemple, le nombre de cellules sécrétant du GLP-1 (souvent appelées cellules L) augmente progressivement de l’intestin proximal à l’intestin distal, alors que les cellules sécrétant du GIP (appelées cellules K) diminuent. Ainsi, les lignées cellulaires entéroendocrines, qui sont toutes dérivées de tumeurs, représentent des systèmes modèles très simples et artificiels pour l’étude de la détection des nutriments, de la sécrétion des hormones intestinales et des mécanismes moléculaires et régulateurs sous-jacents. L’avantage des lignées cellulaires de mammifères est qu’elles sont bien établies par de nombreux laboratoires dans le monde. Il y a beaucoup de données scientifiques disponibles, ainsi que des protocoles expérimentaux établis. En outre, elles sont faciles à manipuler et leur culture est bon marché. Cependant, toutes ces lignées cellulaires sont des systèmes modèles très simples et artificiels. Elles sont pour la plupart dérivées de tumeurs et ne représentent qu’un seul type de cellules, ce qui ne reflète pas la complexité de la muqueuse intestinale qui comprend de multiples types de cellules spécialisées. De plus, elles sont généralement cultivées en deux dimensions, ce qui ne reflète pas l’architecture tridimensionnelle de l’intestin natif.
En particulier, pour les études sur la détection des nutriments et la sécrétion des hormones intestinales, la culture primaire de cellules intestinales est une bien meilleure approche, et a été établie comme un modèle fiable au cours des dernières années (Reimann et al., 2008). Les cultures primaires réalisées à partir de cryptes intestinales isolées ont l’avantage de pouvoir être générées à partir de différents segments intestinaux (Parker et al., 2012) et de souris (animaux de type sauvage ou knock-out) (Diakogiannaki et al., 2013) ou d’humains (Habib et al., 2013). Elles comprennent des entérocytes absorbants, ainsi que différents sous-types de cellules entéroendocrines, comme on en trouve dans l’intestin natif. Cependant, ces cultures contiennent des entérocytes peu différenciés, et ne sont donc pas adaptées à la détection des transporteurs et récepteurs intestinaux au niveau protéique ou fonctionnel. Il s’agit d’un système de culture à court terme qui ne convient pas aux expériences à long terme et qui ne peut pas être passé, ce qui augmente le nombre d’animaux de laboratoire nécessaires à la préparation des cultures. Il en est de même pour les cellules épithéliales intestinales isolées (Grossmann et al., 1998), qui comprennent tous les types de cellules de la muqueuse mais présentent une viabilité très limitée in vitro, et ne représentent pas un épithélium intact.
La stabilité à court terme est également une limitation des explants tissulaires, tels que les anneaux d’intestin éversés (Roder et al, 2014), ou les sacs intestinaux de souris ou de rat (Praslickova et al., 2012 ; Surampalli et al., 2016) qui sont souvent utilisés pour les études de transport. Les anneaux d’intestin en éversion peuvent être soit incubés avec des substrats marqués in vitro, soit préparés après l’administration orale, par exemple, de substrats de transport radio-marqués chez les rongeurs (Roder et al., 2014). Les sacs intestinaux éversés peuvent même être utilisés pour des études de flux, puisque les compartiments luminal et basolatéral peuvent être ciblés séparément. Cependant, la préparation et la manipulation ne sont pas triviales, et nécessitent une certaine expérience. L’avantage des explants tissulaires est qu’ils peuvent être préparés à partir de différents segments intestinaux, et que leurs caractéristiques in vivo spécifiques à la région sont conservées in vitro. L’explant intestinal conserve son architecture native, et la muqueuse est connectée à ses tissus environnants tels que la sous-muqueuse ou le muscle, et les neurones, la lymphe, les vaisseaux sanguins sont inclus. Selon la question scientifique, cela peut être un avantage ou un inconvénient. La détection intestinale des nutriments et la sécrétion ultérieure d’hormones intestinales sont parfois étudiées dans l’intestin perfusé de rongeurs (Kuhre et al., 2015). L’animal est anesthésié et la lumière intestinale est perfusée avec les stimulants putatifs ex vivo. Le fluide basolatéral est recueilli et le contenu hormonal intestinal est analysé. Cette technique n’est pas facile techniquement, et des obstacles éthiques limitent l’utilisation large de cette méthode pour les études sur la libération d’hormones intestinales induite par les nutriments.
Un modèle fiable et bien établi utilisé pour les études sur les caractéristiques fonctionnelles et la régulation des transporteurs intestinaux est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). Après injection d’ARNm, la protéine d’intérêt est exprimée dans l’ovocyte, et la cinétique de transport peut être étudiée à l’aide de substrats radiomarqués ou d’approches électrophysiologiques dans le cas de transporteurs électrogéniques (Schulze et al., 2014 ; Stelzl et al., 2016). Cette technique est un excellent outil pour étudier les caractéristiques fonctionnelles d’un transporteur particulier, bien que la protéine cible se trouve dans un environnement artificiel et qu’aucun facteur de régulation ne soit présent, comme ce serait le cas dans la cellule de mammifère. En outre, la disponibilité d’ovocytes intacts et la manipulation compliquée, y compris l’injection d’ovocytes, sont des questions critiques à prendre en compte lors de l’application de cette technique. Les systèmes d’expression hétérologue beaucoup plus faciles sont la levure et E. coli. Ils permettent la génération de mutants recombinants qui, une fois générés, peuvent être cultivés ou fermentés à plus grande échelle, délivrant de grandes quantités de protéines. Bien que bon marché et faciles à manipuler, ces micro-organismes sont des systèmes modèles très simplifiés pour l’étude des protéines de mammifères, et en particulier des grandes protéines membranaires. Les problèmes qui se posent souvent sont le mauvais repliement de la protéine ou l’échec de l’insertion dans la membrane. Par conséquent, ces systèmes sont plutôt utiles pour la caractérisation structurelle de protéines purifiées ou de domaines protéiques (Beale et al., 2015) que pour des études détaillées sur la fonction et la régulation des transporteurs de mammifères.
De nouvelles approches prometteuses qui ont été établies dans un passé très récent sont des modèles tridimensionnels de culture cellulaire de mammifères. Les lignées cellulaires intestinales telles que CaCo-2 ou HT-29 sont cultivées sur des échafaudages, créant ainsi une architecture plus proche de l’intestin, ce qui conduit à une meilleure différenciation (Chen et al., 2015). D’autres modèles tridimensionnels sont cultivés directement à partir de cellules épithéliales du petit intestin humain et de myofibroblastes sur des membranes microporeuses revêtues (Maschmeyer et al., 2015a ; Maschmeyer et al., 2015b), et ne peuvent pas être multipliés in vitro. Ces modèles ont le potentiel d’être établis pour des études de transport de nutriments ou de médicaments, et les cultures réalisées à partir de cellules épithéliales intestinales humaines comprennent même différents types de cellules muqueuses, mais pas de cellules entéroendocrines. Il en va de même pour les tissus bioprints tridimensionnels, une autre technologie apparue très récemment et qui a suscité une énorme attention. Cette approche est plus intéressante pour la médecine régénérative et la transplantation que pour la recherche expérimentale (Murphy et Atala, 2014). La bio-impression de différents tissus, notamment le cœur, la peau et les os, a été établie avec succès, mais les tissus intestinaux bio-imprimés sont rares à ce jour et doivent être encore améliorés (Wengerter et al., 2016).