Le premier rôle de Rajskub était celui d’un Oompa-Loompa dans une production de théâtre communautaire de Willy Wonka & the Chocolate Factory, et son premier rôle principal était Raggedy Ann. En 1996, elle est apparue dans des clips musicaux pour les chansons « The Good Life » de Weezer et « The New Pollution » de Beck.
De 1996 à 1998, elle a eu un rôle récurrent dans la série HBO The Larry Sanders Show en tant qu’assistante de réservation Mary Lou Collins.
Son rôle le plus notable est celui de Chloe O’Brian, analyste des systèmes de la CTU, dans la série 24, qu’elle a rejoint en 2003 au début de la troisième saison de la série. Son personnage a été un succès auprès des téléspectateurs et des critiques et a été l’un des rares membres du casting à revenir dans la quatrième saison de la série. Après avoir été une guest star régulière pendant deux saisons, Rajskub est devenue un membre principal du casting lors de la cinquième saison de la série. À la fin de la série, elle était la femme principale, avec un rôle de premier plan juste derrière Kiefer Sutherland. Son personnage a également eu l’honneur de prononcer les derniers mots de la série dans le final de la saison 8. Rajskub et Sutherland sont apparus brièvement en tant que leurs 24 personnages dans un épisode de 2007, « 24 Minutes », de la série animée Les Simpsons de Fox. En août 2013, il a été annoncé qu’elle reprendrait son rôle de Chloe O’Brian dans la série limitée de 2014 24 : Live Another Day.
Rajskub était l’un des membres du casting original de Mr. Show. Elle est apparue dans The Sketch Show de Kelsey Grammer sur Fox Television, The King of Queens dans un personnage nommé Priscilla, et dans de nombreux films dont Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car ? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, des clips musicaux pour Beck, Weezer et Sheryl Crow, ainsi que le portrait d’une femme aveugle dans le film Road Trip.
Rajskub faisait partie d’un duo comique (avec Karen Kilgariff) appelé Girls Guitar Club. En 2006, elle a fait une apparition dans « Partings », le final de la 6e saison de Gilmore Girls, où elle jouait un trobairitz à la recherche de sa grande chance. (Rajskub était déjà apparue dans Gilmore Girls en tant que premier rôle féminin dans A Film by Kirk, un court-métrage réalisé par le personnage de Kirk Gleason). Elle a fait du bénévolat en tant qu’actrice dans le cadre du programme Young Storytellers. Elle a une formation de peintre, ayant fréquenté le San Francisco Art Institute.
Rajskub a été nominée deux fois pour un Screen Actors Guild Award ; une fois en 2005, et une autre fois en 2007 pour la meilleure performance d’un ensemble dans une série dramatique. Elle a joué le rôle de Karen, une fanatique d’Art Garfunkel, dans l’épisode « Prime Minister » de Flight of the Conchords. Elle a joué le rôle de « Gail the Snail » dans un épisode de It’s Always Sunny in Philadelphia intitulé « The Gang Gives Frank an Intervention », et a repris ce rôle dans le final de la neuvième saison, « The Gang Squashes Their Beefs », et dans la treizième saison, « The Gang Beats Boggs : Ladies Reboot » de la treizième saison. En 2009, elle est également apparue dans le film Julie & Julia dans le rôle de Sarah, l’une des amies proches de Julie Powell. En 2010, Rajskub a fait du stand-up dans le New York Stand Up Show de John Oliver. En juin 2010, elle est apparue dans l’épisode « Lovesick » lors de la deuxième saison de la série américaine Royal Pains.
De juillet à octobre 2010, elle a joué dans son spectacle solo, Mary Lynn Spreads Her Legs, au Steve Allen Theater de Los Angeles. La critique F. Kathleen Foley du Los Angeles Times a écrit « ce titre joyeusement vulgaire résume le ton général, qui est souvent allègrement obscène ». La série, écrite par Rajskub avec l’aide du réalisateur/développeur Amit Itelman, a été inspirée par les expériences de Rajskub en matière de grossesse, d’accouchement et de maternité précoce.
En janvier 2011, Rajskub a joué en tant que guest-star dans l’épisode « Our Children, Ourselves » de la deuxième saison de Modern Family sur ABC. À l’automne 2011, Rajskub est apparue dans la sitcom éphémère How to Be a Gentleman. Toujours en 2011, la web-série de Rajskub, Dicki, a commencé à être diffusée sur My Damn Channel. Dicki est basée sur un certain nombre de personnes que Rajskub a grandi dans le Michigan et ses environs. Le personnage titre est une femme de 40 ans qui vit chez ses parents, fait de l’artisanat et prend son art au sérieux. Dicki a été l’une des séries web les plus réussies de My Damn Channel à ce jour. La première saison s’est terminée en novembre 2011, mais une deuxième saison est en cours de développement. Rajskub a participé à l’édition de juin 2012 de Don’t Tell My Mother ! (Live Storytelling), un spectacle mensuel dans lequel des célébrités partagent des histoires vraies qu’elles ne voudraient jamais que leurs mères connaissent. Elle anime actuellement un podcast sur le Nerdist Network intitulé Kickin’ it Mary Lynn Style.
En 2013, Rajskub est apparue dans la quatrième saison d’Arrested Development dans un rôle silencieux mais bien accueilli de Heartfire, un personnage dont Rajskub a dit qu’il « parle avec le cœur, mais n’utilise aucun mot. » La même année, Rajskub est également apparue dans la série web All Growz Up avec Melinda Hill.
Rajskub est apparue sur le podcast TV Guidance Counselor de Ken Reid le 27 mars 2015.
En août 2016, Rajskub s’est produite au Festival Fringe d’Édimbourg dans 24 Hours With Mary Lynn Rajskub et elle a été bien accueillie par les fans et les critiques.
En 2017, Rajskub est apparue dans la première saison de la série de Adult Swim Dream Corp LLC, jouant le rôle du patient 46 dans l’épisode « Are You Down With OCD ? ».
En 2018, Rajskub est apparue dans Night School aux côtés de Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe et Keith David.
En 2021, Rajskub a sorti un spécial comédie de 49 minutes appelé Mary Lynn Rajskub : Live from the Pandemic ; il peut être loué ou acheté par le biais de plusieurs services de vidéo à la demande.
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